В первую очередь следует помнить, что ферменты - это белковые вещества и все свойства, характерные для белков, присущи и ферментам. Белковая природа ферментов была признана после того, как Джон Говард Норт- роп (1891 - 1987) в 1930-х гг. получил в кристаллическом виде пепсин и трипсин. Позднее химическая сущность ферментов получила подтверждение с помощью рентгеноструктурного анализа.
При скручивании и сворачивании иолипептидных цепей молекул ферментов в определенную структуру образуются особые участки с характерными свойствами. Их называют центрами фермента: активный , каталитический , субстратный и схематично изображают в виде углублений различной формы в молекуле фермента (рис. 6.2).
Рис. 6.2.
субстратный - место, куда присоединяется субстрат, центр отвечает за специфичность фермента; каталитический - область, где протекает реакция; аллостерический (иначе регуляторный, метаболический) есть не у всех ферментов, реагирует на действие внешних
факторов
По химической природе вес ферменты делят на простые (однокомно- нентные) и сложные (двухкомионентные). Как очевидно из рис. 6.3, разница заключается в том, что в составе сложных ферментов есть небелковый компонент. Он может быть прочно связан с ферментом (простетическая группа) или легко отделяться от него (кофермент ).
Однако, в любом случае, каталитическая реакция протекает при взаимодействии субстрата с небелковой частью сложного фермента.
И простые, и сложные ферменты могут быть представлены разными молекулярными формами (табл. 6.2, рис. 6.3).
В олигомерах, катализирующих одну реакцию, выделяют изоферменты. Изоферменты - это ферменты, катализирующие одну реакцию, но отличающиеся друг от друга аминокислотным составом, последовательностью аминокислот, физико-химическими свойствами, локализацией в разных тканях. Например, глюкокиназа и гексокиназа катализируют одно и то же превращение - образование гл-6-фосфата из глюкозы, но обладают разным сродством к субстрату, разной локализацией и т.д. (см. параграф 10.6)
Таблица 6.2
Молекулярные формы ферментов
Рис. 63.
Важно подчеркнуть, что все центры фермента не жесткие структуры. Они могут изменять форму в процессе ферментативного катализа. Часто с присоединением субстрата происходит одновременное сближение каталитического центра. В таких случаях говорят об одном активном центре фермента.
Нельзя полностью идентифицировать белки и ферменты с живыми существами, но аналогию провести можно. Фермент и субстрат не ждут случайного соударения при хаотичном движении частиц, как это происходит в неорганической химии. В живой клетке превращения протекают как по сценарию. Определенный фермент узнает и захватывает соответствующий ему субстрат, поворачивает, если необходимо, или изменяет свою пространственную конфигурацию, и осуществляет каталитическое превращение. В результате выделяются фермент в неизменном виде и продукт реакции. Существует много примеров, когда фермент тут же передает преобразованный субстрат (продукт) другому ферменту, как по цепочке на конвейере. Этим во многом и объясняется и особая избирательность, и высокая эффективность действия ферментов.
Одним из первых идею о центрах связывания фермента с субстратом высказал немецкий химик-органик Эмиль Герман Фишер (1852-1919). Его теория получила название «ключа и замка» (рис. 6.4). Это значит, что форма активного центра фермента должна подходить к субстрату, как ключ к замку.
В соответствии с общей схемой ферментативного катализа (см. рис. 6.1) фермент и подходящий ему по форме субстрат образуют фермент-субст-
Рис. 6.4.
стадии I, II, III соответствуют общей схеме ферментативного катализа
ратный комплекс, в котором происходят определенные изменения, способствующие образованию активированного фермснт-субстратного комплекса. В результате выделяются новый продукт и фермент в неизменном виде.
Основное положение этой теории абсолютно справедливо и сейчас, но по мере изучения структур различных ферментов представления о ферментативном катализе значительно расширились. Известно, что у ряда ферментов активный центр может изменять форму в зависимости от окружающих условий. Речь идет об аллостерических ферментах , имеющих аллостерический (регуляторный, метаболический) центр, чувствительный к действию различных клеточных метаболитов.
Аллостерический центр всегда пространственно удален от субстратного и каталитического центра и обладает характерной специфичностью, т.е. связывает только индивидуальные для него лиганды. Связывание всегда не ковалентно и обратимо.
Метаболиты, присоединяющиеся к аллостерическому центру, называются общим термином: эффекторы. Однако по направлению оказываемого ими эффекта их делят на две группы:
- активаторы увеличивают активность фермента, т.е. обладают положительной стимуляцией;
- ингибиторы уменьшают активность фермента, т.е. обладают отрицательной стимуляцией.
Активаторами часто являются исходные вещества, а ингибиторами - продукты реакции. Например, гексокиназа ингибируется продуктом реакции - гл-6-фосфатом, а активность синтазы-ВЖК (см. подпараграф 11.8.2.) снижается при высокой концентрации продукта процесса - пальмитил-КоА.
В некоторых ферментах есть несколько аллостерических центров, каждый из которых специфичен к своему эффектору.
Таким образом, в аллостерических ферментах сценарий процесса будет зависеть от окружающих условий: наличия метаболических активаторов или ингибиторов.
Эта особенность ферментов учитывается теорией «индуцированного (вынужденного ) взаимодействия» Дэниела Кошланда (1920-2007). В соответствии с этой теорией после образования фермент-субстратного комплекса, в молекуле фермента могут наблюдатьея некие конфирмационные изменения, которые индуцируют соответствующие изменения в молекуле субстрата. Эти сведения подтверждены методом рентгеноструктурного анализа. Также ряд свойств ферментов указывает на различие их конформации в отсутствии и присутствии субстрата. У некоторых ферментов в присутствии субстрата меняются оптические и седиментационные характеристики, возрастает устойчивость к тепловой денатурации, прекращается диссоциация на субъединицы.
- Дж. Г. Нортроп совместное Уэнделлом Мередит Стенли и Джеймсом Бстчеллсром Самнером удостоены Нобелевской премии по химии «За получение в чистом виде вирусных белков» в 1946 г.
Кафедра биохимии
КУРС ЛЕКЦИЙ
ПО ОБЩЕЙ БИОХИМИИ
для студентов 2 курса
лечебно-профилактического
факультета
Модуль 1. Ферменты
Екатеринбург,
ЛЕКЦИЯ № 1
Тема: Введение в биохимию. Ферменты: строение, свойства, локализация, номенклатура и классификация
Биохимия – наука, изучающая вещества, входящие в состав живых организмов, их превращения, а также взаимосвязь этих превращений с деятельностью органов и тканей.
Биохимия – наука, о химических основах процессов жизнедеятельности.
Биохимия - молодая наука, около ста лет назад она возникла на стыке физиологии и органической химии. Термин биохимия ввел в 1903г молодой немецкий биохимик Карл Нейберг (1877-1956).
Современная биохимия как наука делится на:
1) статическую (анализирует структуру и химический состав организмов);
2) динамическую (изучает обмен веществ и энергии в организме);
3) функциональную (исследует взаимодействие химических процессов с биологическими и физиологическими функциями).
По объектам исследования, биохимия делиться на:
1) биохимию человека и животных;
2) биохимию растений;
3) биохимию микроорганизмов;
4) вирусов.
Мы с вами будем заниматься медицинской биохимией, одним из разделов биохимии человека и животных.
Предметом медицинской биохимии является человек.
Цельюкурса медицинской биохимии является изучение:
1) молекулярных основ физиологических функций человека;
2) молекулярных механизмов патогенеза болезней;
3) биохимических основ предупреждения и лечения болезней;
4) биохимических методов диагностики болезней и контроля эффективности лечения.
Задачи курса медицинской биохимии:
1) изучить теоретический материал;
2) получить практический навык биохимических исследований;
3) научиться интерпретировать результаты биохимических исследований.
Медицинская биохимия связана со всеми фундаментальными и клиническими медицинскими дисциплинами. Патогенез любой патологии включает в себя нарушение нормальных биохимических процессов, лежащих в основе физиологических функций организма, а излечение патологии – нормализация нарушенных биохимических процессов и физиологических функций организма. Поэтому, биохимия является фундаментальной наукой для врача.
Ферменты. Химическая природа, физико-химические свойства и биологическая роль .
Основу жизнедеятельности любого организма составляют химические процессы. Практически все реакции в живом организме протекают с участием природных биокатализаторов, называемых ферментами или энзимами.
Ферменты - это белки (установлено в 1922г), которые действуют как катализаторы в биологических системах.
Являясь веществами белкой природы, ферменты обладают всеми свойствами белков:
1. являются амфотерными соединениями;
2. вступают в те же качественные реакции, что и белки (биуретовую, ксантопротеиновую, фолина и др.);
3. подобно белкам растворяются в воде с образованием коллоидных растворов;
4. обладают электрофоретической активностью;
5. гидролизуются до аминокислот;
6. склонны к денатурации под влиянием тех же факторов: температуры, изменениях рН, действием солей тяжелых металлов, действием физических факторов (ультразвук, ионизирующее излучение и др.);
7. имеют несколько уровней организации макромолекул, что подтверждено данными рентгеноструктурного анализа, ЯМР, ЭПР.
Биологическая роль ферментов заключается в том, что они катализируют контролируемое протекание всех метаболических процессов в организме.
Строение ферментов
Метаболит - вещество, которое участвует в метаболических процессах.
Субстрат – вещество, которое вступает в химическую реакцию.
Продукт – вещество, которое образуется в ходе химической реакции.
Ферменты характеризуются наличием специфических центров катализа.
Активный центр (Ац) – это часть молекулы фермента, которая специфически взаимодействует с субстратом и принимает непосредственное участие в катализе. Ац, как правило, находиться в нише (кармане). В Ац можно выделить два участка: участок связывания субстрата – субстратный участок (контактная площадка) и собственно каталитический центр .
Большинство субстратов образует, по меньшей мере, три связи с ферментом, благодаря чему молекула субстрата присоединяется к активному центру единственно возможным способом, что обеспечивает субстратную специфичность фермента. Каталитический центр обеспечивает выбор пути химического превращения и каталитическую специфичность фермента.
У группы регуляторных ферментов есть аллостерические центры , которые находятся за пределами активного центра. К аллостерическому центру могут присоединяться “+” или “–“ модуляторы, регулирующие активность ферментов.
Различают ферменты простые, состоят только из аминокислот, и сложные, включают также низкомолекулярные органические соединения небелковой природы (коферменты) и (или) ионы металлов (кофакторы).
Коферменты – это органические вещества небелковой природы, принимающие участие в катализе в составе каталитического участка активного центра. В этом случае белковую составляющую называют апоферментом , а каталитически активную форму сложного белка – холоферментом . Таким образом: холофермент = апофермент + кофермент.
В качестве коферментов функционируют:
· нуклеотиды,
· коэнзим Q,
· Глутатион
· производные водорастворимых витаминов:
Кофермент, который присоединен к белковой части ковалентными связями называется простетической группой . Это, например, FAD, FMN, биотин, липоевая кислота. Простетическая группа не отделяется от белковой части. Кофермент, который присоединен к белковой части нековалентными связями называется косубстрат . Это, например, НАД + , НАДФ + . Косубстрат присоединяется к ферменту в момент реакции.
Кофакторы ферментов – это ионы металлов, необходимые для проявления каталитической активности многих ферментов. В качестве кофакторов выступают ионы калия, магния, кальция, цинка, меди, железа и т.д. Их роль разнообразна, они стабилизируют молекулы субстрата, активный центр фермента, его третичную и четвертичную структуру, обеспечивают связывание субстрата и катализ. Например, АТФ присоединяется к киназам только вместе с Mg 2+ .
Изоферменты – это множественные формы одного фермента, катализирующие одну и ту же реакцию, но отличающие по физическим и химическим свойствам (сродству к субстрату, максимальной скорости катализируемой реакции, электрофоретической подвижности, разной чувствительности к ингибиторам и активаторам, оптимуму рН и термостабильности). Изоферменты имеют четвертичную структуру, которая образована четным количеством субъединиц (2, 4, 6 и т.д.). Изоформы фермента образуются в результате различных комбинаций субъединиц.
В качестве примера можно рассмотреть лактатдегидрогеназу (ЛДГ), фермент, который катализирует обратимую реакцию:
НАДН 2 НАД +
пируват ← ЛДГ → лактат
ЛДГ существует в виде 5 изоформ, каждая из которых состоит из 4-х протомеров (субъединиц) 2 типов М (muscle) и Н (heart). Синтез протомеров М и Н типа кодируется двумя разными генетическими локусами. Изоферменты ЛДГ различаются на уровне четвертичной структуры: ЛДГ 1 (НННН), ЛДГ 2 (НННМ), ЛДГ 3 (ННММ), ЛДГ 4 (НМММ), ЛДГ 5 (ММММ).
Полипептидные цепи Н и М типа имеют одинаковую молекулярную массу, но в составе первых преобладают карбоновые аминокислоты, последних – диаминокислоты, поэтому они несут разный заряд и могут быть разделены методом электрофореза.
Кислородный обмен в тканях влияет на изоферментный состав ЛДГ. Где доминирует аэробный обмен, там преобладают ЛДГ 1 , ЛДГ 2 (миокард, надпочечники), где анаэробный обмен - ЛДГ 4 , ЛДГ 5 (скелетная мускулатура, печень). В процессе индивидуального развития организма в тканях происходит изменение содержания кислорода и изоформ ЛДГ. У зародыша преобладают ЛДГ 4 , ЛДГ 5 . После рождения в некоторых тканях происходит увеличение содержания ЛДГ 1 , ЛДГ 2 .
Существование изоформ повышает адаптационную возможность тканей, органов, организма в целом к меняющимся условиям. По изменению изоферментного состава оценивают метаболическое состояние органов и тканей.
Локализация и компартментализация ферментов в клетке и тканях .
Ферменты по локализации делят на 3 группы:
I – общие ферменты (универсальные)
II - органоспецифические
III - органеллоспецифические
Общие ферменты обнаруживаются практически во всех клетках, обеспечивают жизнедеятельность клетки, катализируя реакции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот, образование биомембран и основных клеточных органелл, энергообмен. Общие ферменты разных тканей и органов, тем не менее, отличаются по активности.
Органоспецифичные ферменты свойственны только определенному органу или ткани. Например: Для печени – аргиназа. Для почек и костной ткани – щелочная фосфатаза. Для предстательной железы – КФ (кислая фосфатаза). Для поджелудочной железы – α-амилаза, липаза. Для миокарда – КФК (креатинфосфокиназа), ЛДГ, АсТ и т.д.
Внутри клеток ферменты также распределены неравномерно. Одни ферменты находятся в коллоидно-растворенном состоянии в цитозоле, другие вмонтированы в клеточных органеллах (структурированное состояние).
Органеллоспецифические ферменты . Разным органеллам присущ специфический набор ферментов, который определяет их функции.
Органеллоспецифические ферменты это маркеры внутриклеточных образований, органелл:
1) Клеточная мембрана: ЩФ (щелочная фосфатаза), АЦ (аденилатциклаза), К-Nа-АТФаза
2) Цитоплазма: ферменты гликолиза, пентозного цикла.
3) ЭПР: ферменты обеспечивающие гидроксилирование (микросомальное окисление).
4) Рибосомы: ферменты обеспечивающие синтез белка.
5) Лизосомы: содержат гидролитические ферменты, КФ (кислая фосфатаза).
6) Митохондрии: ферменты окислительного фосфорилирования, ЦТК (цитохромоксидаза, сукцинатдегидрогеназа), β-окисления жирных кислот.
7) Ядро клетки: ферменты обеспечивающие синтез РНК, ДНК (РНК-полимераза, НАД-синтетаза).
8) Ядрышко: ДНК-зависимая-РНК-полимераза
В результате в клетке образуются отсеки (компартменты), которые отличаются набором ферментов и метаболизмом (компартментализация метаболизма).
Среди ферментов выделяется немногочисленная группа регуляторных ферментов, которые способны отвечать на специфические регуляторные воздействия изменением активности. Эти ферменты имеются во всех органах и тканях и локализуются в начале или в местах разветвления метаболических путей.
Строгая локализация всех ферментов закодирована в генах.
Определение в плазме или сыворотке крови активности органо- органеллоспецифических ферментов широко используется в клинической диагностике.
Оксидоредуктазы
Катализируют окислительно-восстановительные реакции. В реакцию вступают 2 вещества и 2 образуются, одно окисляется, другое восстанавливается: Sвост + S’окисл ↔ S’вост + Sокисл
Оксидоредуктазы делятся на: дегидрогеназы (отщепляют Н от субстратов), оксидазы (переносят Н с субстрата на кислород), оксигеназы (включают кислород в молекулу субстрата), гидроксипероксидазы (разрушают перекиси водорода и органические перекиси).
Систематическое название включает в себя название донора е и Н + через двоеточие название акцептора через тире – название класса: донор: акцептор (косубстрат) оксидоредуктаза
R-CH 2 -OH + НАД + ↔ R-CH=О + НАДН 2
Систематическое название: Алкоголь: НАД + оксидоредуктаза
Тривиальное название: алкогольдегидрогеназа. Шифр: КФ 1.1.1.1
Пируват + НАДН 2 ↔ лактат + НАД +
Систематическое название: Лактат: НАД + оксидоредуктаза
Тривиальное название: ЛДГ. Шифр: КФ 1.1.2.7
Трансферазы
Ферменты этого класса принимают участие в переносе атомных групп, молекулярных остатков от одного соединения к другому. В реакцию вступают 2 вещества и 2 образуются: S-G + S’ ↔ S + S’-G.
В зависимости от переносимых групп трансферазы делятся на: 1). фосфотрансферазы (киназы); 2). аминотрансферазы; 3). гликозилтрансферазы; 4). метилтрансферазы; 5). ацилтрансферазы.
Систематическое название : откуда: куда в какое положение–что–трансфераза
или донор: акцептор–транспортируемая группа– трансфераза
АТФ + D-гексоза ↔ АДФ + D- гексоза-6ф
Систематическое название: АТФ: D-гексоза-6-фосфотрансфераза
Тривиальное название: гексокиназа
ФЕП + АДФ → ПВК + АТФ
Систематическое название: АТФ: ПВК-2-фосфотрансфераза
Тривиальное название: пируваткиназа
3. Гидролазы. Расщепляют ковалентную связь с присоединением молекулы воды.
В реакцию вступают 2 вещества и 2 образуются: S-G + Н 2 О ↔ S-ОН + G-Н.
В зависимости от характера гидролизуемой связи, различают подклассы: 1). гликозидазы – гидролиз гликозидов (лактоза – лактаза, мальтоза – мальтаза, сахароза – сахараза); 2). пептидазы – гидролиз пептидных связей; 3). эстеразы – разрыв связи в сложных эфирах.
Систематическое название субстрат–что отщепляется–гидролаза
или субстрат–гидролаза
Ацетилхолин + Н 2 О ↔ Ацетат + Холин
Систематическое название: Ацетилхолин-ацилгидролаза (Ацетилхолин-гидролаза)
Тривиальное название: Ацетилхолинэстераза
Глюкозо-6ф + Н 2 О → глюкоза + Н 3 РО 4
Систематическое название: Глюкозо-6ф-фосфогидролаза
Тривиальное название: Глюкозо-6ф-фосфотаза
Лиазы
Отщепление групп от субстратов по негидролитическому механизму с образованием двойных связей (или наоборот, присоединение по двойной связи). Реакции обратимы, за исключением отщепления СО 2 .
В реакцию вступает 1 вещество и 2 образуются (или наоборот): -SХ-SY- ↔ XY + -S=S-
Систематическое название субстрат: что отщепляется–лиаза
L-малат ↔ фумарат + Н 2 О
Систематическое название: L-малат: гидро– лиаза
Тривиальное название: фумараза
Изомеразы
Взаимопревращения оптических, геометрических, позиционных изомеров. В реакцию вступает 1 вещество и 1 образуется. Исходя из типа катализируемой реакции изомеризации выделяется несколько подклассов: 1) рацемазы; 2) эпимеразы; 3) таутамеразы; 4) цис,- трансизомеразы; 5) мутазы (при внутримолекулярном переносе группы); 6) цикло-, оксоизомеразы.
Систематическое название субстрат –вид изомеризации –изомераза или субстрат –продукт –изомераза
Фумаровая к-та ↔ малеиновая к-та
Систематическое название: фумарат– цис,транс– изомераза
гл-6ф ↔ фр-6ф
Систематическое название: гл-6ф– фр-6ф– изомераза
Лигазы (синтетазы)
Соединение 2 молекул с использованием энергии макроэргических соединений (АТФ и др). В реакцию вступают 3 вещества, образуется 3 вещества.
Систематическое название субстрат: субстрат –лигаза (источник энергии)
АТФ + L-глутамат + NH 4 + → АДФ + Фн + L-глутамин
Систематическое название: L-глутамат: аммиак– лигаза (АТФ → АДФ + Фн)
Тривиальное название: глутаминсинтетаза
АТФ + ПВК + СО 2 → АДФ + Фн + ЩУК
Систематическое название: ПВК: СО 2 – лигаза (АТФ → АДФ + Фн)
Тривиальное название: пируваткарбокилаза
ЛЕКЦИЯ № 2
Клеточная сигнализация
В многоклеточных организмах поддержание гомеостаза обеспечивают 3 системы:
1). нервная, 2). гуморальная, 3). иммунная.
Регуляторные системы функционируют с участием сигнальных молекул.
Сигнальные молекулы – это органические вещества, которые переносят информацию.
К сигнальным молекулам относятся гормоны, нейромедиаторы, факторы роста, цитокины и эйкозаноиды.
ЦНС для передачи сигнала использует нейромедиаторы, гуморальная система – гормоны, иммунная - цитокины.
Гормоны, это сигнальные молекулы беспроводного системного действия.
Отличием истинных гормонов от других сигнальных молекул, является то, что они синтезируются в специализированных эндокринных клетках, транспортируются кровью и действуют дистантно на ткани мишени.
Гормоны по строению делятся: на
белковые (гормоны гипоталамуса, гипофиза),
производные аминокислот (тиреоидные, катехоламины)
и стероидные (половые, кортикоиды).
Пептидные гормоны и катехоламины растворимы в воде, они регулируют преимущественно каталитическую активность ферментов.
Стероидные и тиреоидные гормоны водонерастворимы, они регулируют преимущественно количество ферментов.
Гормоны влияют на активность и количество ферментов в клетке не напрямую, а через каскадные системы (аденилатциклазную, гуанилатциклазную, инозитолтрифосфатную, RAS и т.д.), состоящие из:
1. рецепторов;
2. регуляторных белков (G-белки, IRS, Shc, STAT и т.д.).
3. вторичных посредников, (messenger - посыльный) (Са 2+ , цАМФ, цГМФ, ДАГ, ИТФ);
4. ферментов (аденилатциклаза, фосфолипаза С, фосфодиэстераза, протеинкиназы А, С, G, фосфопротеинфосфотаза);
Необходимость каскадных систем связана с тем, что, во-первых, водорастворимые гормоны не проходят клеточную мембрану, во-вторых, эти системы обеспечивают усиление первичного сигнала гормонов в миллионы раз. В результате даже одна молекула гормона способна активировать миллионы ферментов и вызвать метаболический эффект.
Водонерастворимые гормоны самостоятельно проходят клеточные мембраны и реализуют свой эффект с участием цитоплазматических и ядерных рецепторов.
Рецепторы
Рецепторы - это белки, встроенные в клеточную мембрану или находящиеся внутри клетки, которые, взаимодействуя с сигнальными молекулами, меняют активность регуляторных белков.
По локализации рецепторы делятся на : 1) цитоплазматические; 2) ядерные; 3) мембранные.
По эффекту рецепторы делятся на: активаторные (активируют каскадные системы) и ингибиторные (блокируют каскадные системы).
Регуляторные белки
G-белки - универсальные посредники, передающие сигнал от рецепторов к ферментам клеточных мембран.
В настоящее время известно более 50 G-белков:
· Gs-белок активирует аденилатциклазу . Масса 80000-90000Да.
· Gi-белок ингибирует аденилатциклазу . Масса 80000-90000Да. Через рецептор, активируется соматостатином.
· Gq-белок активирует фосфолипазу С .
· G-белки влияют на активность фосфодиэстеразы , фосфолипазы А 2 , некоторые типы Са 2+ - и K + -каналов .
· G-белки также обеспечивают передачу сигнала в сенсорных клетках (фоторецепторных, обонятельных и вкусовых): Свет → родопсин → Gt → ФДЭ цГМФ → (цГМФ→ГМФ)
G-белки олигомеры, состоят из 3 субъединиц α, β, γ.
β-субъединицы (35000 Да) у Gs- и Gi-белков одинаковы.
α- субъединицы (41000 Да у Gi, 45000 Да у Gs) кодируются разными генами и обеспечивают специфический ответ (“+” или “-”).
STAT белки.
Ферменты
Ферменты каскадных систем катализируют:
- образование вторичных посредников гормонального сигнала;
- активацию и ингибирование других ферментов;
- превращение субстратов в продукты;
Аденилатциклаза (АЦ)
Гликопротеин с массой от 120 до 150 кДа, имеет 8 изоформ, ключевой фермент аденилатциклазной системы, с Mg 2+ катализирует образование вторичного посредника цАМФ из АТФ.
АЦ содержит 2 –SH группы, одна для взаимодействия с G-белком, другая для катализа. АЦ содержит несколько аллостерических центров: для Mg 2+ , Mn 2+ , Ca 2+ , аденозина и форсколина.
Есть во всех клетках, располагается на внутренней стороне клеточной мембраны. Активность АЦ контролируется: 1) внеклеточными регуляторами - гормонами, эйкозаноидами, биогенными аминами через G-белки; 2) внутриклеточным регулятором Са 2+ (4 Са 2+ -зависимые изоформы АЦ активируются Са 2+).
Протеинкиназа А (ПК А)
ПК А есть во всех клетках, катализируют реакцию фосфорилирования ОН- групп серина и треонина регуляторных белков и ферментов, участвует в аденилатциклазной системе, стимулируется цАМФ. ПК А состоит из 4 субъединиц: 2 регуляторных R (масса 38000 Да) и 2 каталитических С (масса 49000 Да). Регуляторные субъединицы имеют по 2 участка связывания цАМФ. Тетрамер не обладает каталитической активностью. Присоединение 4 цАМФ к 2 субъединицам R приводит к изменению их конформации и диссоциации тетрамера. При этом высвобождаются 2 активные каталитические субъединицы С, которые катализируют реакцию фосфорилирования регуляторных белков и ферментов, что изменяет их активность.
Протеинкиназа С (ПК С)
ПК С участвует в инозитолтрифосфатной системе, стимулируется Са 2+ , ДАГ и фосфатидилсерином. Имеет регуляторный и каталитический домен. ПК С катализирует реакцию фосфорилирования белков-ферментов.
Протеинкиназа G (ПК G) есть только в легких, мозжечке, гладких мышцах и тромбоцитах, участвует в гуанилатциклазной системе. ПК G содержит 2 субъединицы, стимулируется цГМФ, катализирует реакцию фосфорилирования белков-ферментов.
Фосфолипаза С (ФЛ С)
Гидролизует фосфоэфирную связь в фосфатидилинозитолах с образованием ДАГ и ИФ 3 , имеет 10 изоформ. ФЛ С регулируется через G-белки и активируется Са 2+ .
Фосфодиэстеразы (ФДЭ)
ФДЭ превращает цАМФ и цГМФ в АМФ и ГМФ, инактивируя аденилатциклазную и гуанилатциклазную систему. ФДЭ активируется Са 2+ , 4Са 2+ -кальмодулином, цГМФ.
NO-синтаза – это сложный фермент, представляющий собой димер, к каждой из субъединиц которого присоединено несколько кофакторов. NO-синтаза имеет изоформы.
Синтезировать и выделять NO способно большинство клеток организма человека и животных, однако наиболее изучены три клеточные популяции: эндотелий кровеносных сосудов, нейроны и макрофаги. По типу синтезирующей ткани NO-синтаза имеет 3 основные изоформы: нейрональную, макрофагальную и эндотелиальную (обозначаются соответственно как NO-синтаза I, II и III).
Нейрональная и эндотелиальная изоформы NO-синтазы постоянно присутствуют в клетках в небольших количествах, и синтезируют NO в физиологических концентрациях. Их активирует комплекс кальмодулин-4Са 2+ .
NO-синтаза II в макрофагах в норме отсутствует. При воздействии на макрофаги липополисахаридов микробного происхождения или цитокинов они синтезируют огромное количество NO-синтазы II (в 100-1000 раз больше чем NO-синтазы I и III), которая производит NO в токсических концентрациях. Глюкокортикоиды (гидрокортизон, кортизол), известные своей противовоспалительной активностью, ингибируют экспрессию NO-синтазы в клетках.
Действие NO
NO - низкомолекулярный газ, легко проникает через клеточные мембраны и компоненты межклеточного вещества, обладает высокой реакционной способностью, время его полураспада в среднем не более 5 с, расстояние возможной диффузии небольшое, в среднем 30 мкм.
В физиологических концентрациях NO оказывает мощное сосудорасширяющее действие :
· Эндотелий постоянно продуцирует небольшие количества NO.
· При различных воздействиях – механических (например, при усилении тока или пульсации крови), химических (липополисахариды бактерий, цитокины лимфоцитов и кровяных пластинок и т.д.) – синтез NO в эндотелиальных клетках значительно повышается.
· NO из эндотелия диффундирует к соседним гладкомышечным клеткам стенки сосуда, активирует в них гуанилатциклазу, которая синтезирует через 5с цГМФ.
· цГМФ приводит к снижению уровня ионов кальция в цитозоле клеток и ослаблению связи между миозином и актином, что и позволяет клеткам через 10 с расслабляться.
На этом принципе действует препарат нитроглицерин. При расщеплении нитроглицерина образуется NO, приводящий к расширению сосудов сердца и снимающий в результате этого чувство боли.
NO регулирует просвет мозговых сосудов. Активация нейронов какой-либо области мозга приводит к возбуждению нейронов, содержащих NO-синтазу, и/или астроцитов, в которых также может индуцироваться синтез NO, и выделяющийся из клеток газ приводит к локальному расширению сосудов в области возбуждения.
NO участвует в развитии септического шока, когда большое количество микроорганизмов, циркулирующих в крови, резко активируют синтез NO в эндотелии, что приводит к длительному и сильному расширению мелких кровеносных сосудов и как следствие – значительному снижению артериального давления, с трудом поддающемуся терапевтическому воздействию.
В физиологических концентрациях NO улучшает реологические свойства крови :
NO, образующийся в эндотелии, препятствует прилипанию лейкоцитов и кровяных пластинок к эндотелию и также снижает агрегацию последних.
NO может выступать в роли антиростового фактора, препятствующего пролиферации гладкомышечных клеток стенки сосудов, важного звена в патогенезе атеросклероза.
В больших концентрациях NO оказывает на клетки (бактериальные, раковые и т.д) цитостатическое и цитолитическое действие следующим образом:
· при взаимодействии NO с радикальным супероксид анионом образуется пероксинитрит (ONOO-), который является сильным токсичным окислителем;
· NO прочно связывается с геминовой группой железосодержащих ферментов и ингибирует их (ингибирование митохондриальных ферментов окислительного фосфорилирования блокирует синтез АТФ, ингибирование ферментов репликации ДНК способствуют накоплению в ДНК повреждений).
· NO и пероксинитрит могут непосредственно повреждать ДНК, это приводит к активации защитных механизмов, в частности стимуляции фермента поли(АДФ-рибоза) синтетазы, что еще больше снижает уровень АТФ и может приводить к клеточной гибели (через апоптоз).
Литература
- Филиппов П.П. «Как внешние сигналы передаются внутрь клетки». Соросовский образовательный журнал, № 3, 1998, с 28-34.
ЛЕКЦИЯ № 3
I. Энзимопатология
Энзимопатология – это наука, которая изучает энзимопатии.
Энзимопатии – это группа заболеваний, которые вызваны различными дефектами ферментов. Энзимопатий делятся на: наследственные (первичные) и приобретенные (вторичные).
Наследственные энзимопатии
Наследственные энзимопатии – это заболевания, вызванные наследственными нарушениями биосинтеза ферментов или их структуры и функции.
Полное или частичное нарушения биосинтеза ферментов вызывают дефекты генов регуляторных белков, которые контролируют синтез ферментов:
Нарушение структуры и функции ферментов вызывают дефекты генов этих ферментов:
У образовавшегося фермента наблюдаются структурные изменения, которые проявляются в изменении его каталитической активности (как правило, она исчезает), чувствительности к активаторам и ингибиторам, сродству к субстратам, оптимумам рН, температуры. В связи с этим изучением констант фермента является решающим в постановке диагноза врожденных энзимопатий.
Наследственные энзимопатии по типу нарушений метаболизма делят на:
1. нарушения обмена аминокислот: фенилкетонурия, альбинизм, алкаптонурия и др.;
2. нарушения углеводного обмена: галактоземия, наследственная непереносимость фруктозы, гликогенозы;
3. нарушения липидного обмена: липидозы;
4. нарушения обмена нуклеиновых оснований: подагры, синдрома Леш-Нихана и др.;
5. нарушение обмена в соединительной ткани: мукополисахаридозы, хондродистрофия и др.;
6. дефекты ферментов в ЖКТ: муковисцидоз, целиакия, непереносимость лактозы и др.
7. нарушения обмена стероидов и т.д.
В норме метаболический путь протекает следующим образом:
Из-за дефекта в метаболическом пути (цикле, шунте) одного из ферментов в организме происходит накопление промежуточных продуктов (часто токсичных в высоких концентрациях) и дефицит жизненно необходимых конечных продуктов, что приводит к клиническим проявлениям:
Пример: фенилпировиноградная олигофрения – наследственное заболевание, приводящее в раннем детстве к гибели ребенка или к развитию у него тяжелой умственной отсталости.
Причиной заболевания является отсутствие в печени фермента фен-4-монооксигеназы, которая обеспечивает превращение незаменимой аминокислоты Фен в Тир:
Эта реакция необходима для катаболизма Фен, т.е. удаления его излишков. При отсутствии фен-4-монооксигеназы в организме происходит накопление Фен и превращение его в различные производные: фенилпировиноградную, фенилмолочную и фенилуксусную кислоты.
Фен и его производные в высоких концентрациях токсичны, накапливаясь в тканях, они оказывают на них повреждающее действие. Самой чувствительной к Фен и его производным оказывается нервная ткань детей, она поражается в первую очередь.
Диагноз фенилкетонурия ставят на основании обнаружения Фен в крови или фенилпировиноградной кислоты на пеленках детей. Лечение в основном сводится к исключению из питания ребенка Фен. Для такого ребенка Тир оказывается незаменимой аминокислотой.
Другое тяжелое наследственное заболевание – галактеземия (непереносимость молочного сахара), связано с отсутствием синтеза в печени ферментов, катализирующих превращение галактозы в глюкозу. В результате в раннем возврате происходит накопление в тканях галактозы, приводящее к развитию катаракты, поражению печени, мозга, нередко вызывающее гибель ребенка. Лечение в данном случае сводиться к исключению из диеты молочного сахара.
Приобретенные энзимопатии
Приобретенные энзимопатии делятся на: алиментарные, токсические и вызванные различными патологическими состояниями организма.
А). Алиментарные энзимопатии – это заболевания, вызванные изменением количества и активности ферментов вследствие нарушения характера питания.
Алиментарные энзимопатии вызываются дефицитом или дисбалансом в пище:
ü витаминов (гипо-, авитаминозы);
ü макро- и микроэлементов;
ü аминокислот;
ü жирных кислот;
ü других БАВ
Например, алиментарная энзимопатия, вызванная недостаточностью витамина А, проявляется нарушением сумеречного зрения (куриная слепота), воспалением слизистых глаз, ЖКТ, кожи.
Б). Токсические энзимопатии – это заболевания, вызванные нарушением активности ферментов вследствие действия токсических веществ. Токсическим веществами являются многие ксенобиотики (соли тяжелых металлов, пестициды, гербециды и т.д.), а также некоторые метаболиты в высоких концентрациях (алкоголь).
Токсические вещества могут либо избирательно угнетать активность (через денатурацию или ингибирование) или синтез отдельных ферментов, либо угнетать весь биосинтез белка (и соответственно всех ферментов).
Примеры:
ü Цианиды и СО прочно связываются с геминовым Fe активного центра цитохромов, что угнетает их активность;
ü Фториды угнетают активность ферментов, содержащих в активном центре Mg 2+ ;
ü Ингибиторы, содержащиеся в соевых продуктах, яйцах домашней птицы угнетают активность протеаз ЖКТ - трипсина, химотрипсина, эластазы;
ü Антивитамины, присутствующие в некоторых пищевых продуктах, или разрушают витамины или конкурентно замещают их в молекулах ферментов, что приводит к угнетению активности этих ферментов.
В). Энзимопатии, вызванные различными патологическими состояниями организма . Так как ферменты имеют оптимумы t, рН и давления, практически любое заболевание, вызывающее нарушения КОС, изменение температуры тела, концентрации активаторов и ингибиторов, меняет активность ферментов организма.
Например, при ацидозе и повышении температуры возрастает активность катаболических (лизосом) и падает активность анаболических ферментов.
Ферменты в медицинской практике находят применение в качестве диагностических (энзимодиагностика) и терапевтических (энзимотерапия) средств.
II Энзимодиагностика
Энзимодиагностика (энзим[ы] + греч. diagnostikos способный распознавать) – методы диагностики болезней, патологических состояний и процессов, основанные на определении активности ферментов в биологических жидкостях.
Направления энзимодиагностики:
III Энзимотерапия
Энзимотерапия – применение ферментов животного, бактериального или растительного происхождения и регуляторов активности ферментов с лечебной целью.
Внедрению ферментных препаратов в современную клиническую практику способствовало развитие технологий получения обогащенных ферментами препаратов и очищенных ферментов.
В энзимотерапии существует насколько направлений:
1. Лекарственные препараты на основе ферментов . В качестве лекарственных препаратов наиболее широко используются гидролитические ферменты.
1). Протеолитические ферменты применяются при нарушении пищеварения. Например:
а). Экстракты слизистой оболочки желудка, основным действующим веществом которых является пепсин. Это препараты абомин и ацидинпепсин , их в основ
ФЕРМЕНТЫ
Функции ферментов сводятся к ускорению химических реакций, причем ферменты отличаются от других катализаторов тремя уникальными свойствами:
∙ высокой эффективностью действия;
∙ специфичностью действия;
∙ способностью к регуляции;
Тип катализируемой реакции |
||||||
Оксидоредуктазы |
Окислительно- |
|||||
восстановительные реакции. |
||||||
Перенос отдельных групп атомов |
||||||
Трансферазы |
донорной |
молекулы |
||||
акцепторной молекуле. |
||||||
Гидролазы |
Гидролитическое (с |
участием |
||||
воды) расщепление связей. |
||||||
Расщепление |
способом, |
|||||
отличным от |
гидролиза |
|||||
окисления. |
||||||
Изомеразы |
Взаимопревращение |
различных |
||||
изомеров. |
||||||
Образование |
в реакции |
|||||
Лигазы (синтетазы) |
конденсации |
различных |
||||
соединений |
(используется |
|||||
энергия АТР). |
||||||
В живой клетке множество разнообразных соединений, но реакции между ними не беспорядочны, а образуют строго определенные метаболические пути, характерные для данной клетки. Индивидуальность клетки в большой степени определяется уникальным набором ферментов, который она генетически запрограммирована производить. Отсутствие даже одного фермента или какой-нибудь его дефект могут иметь очень серьезные отрицательные последствия для организма.
Кофакторы ферментов
Все ферменты относятся к глобулярным белкам, причем каждый фермент выполняет специфическую функцию, связанную с присущей ему глобулярной структурой. Однако активность многих ферментов зависит от небелковых соединений, называемых кофакторами. Молекулярный комплекс белковой части (апофермента) и кофактора называется холоферментом. Роль кофактора могут выполнять ионы металлов (Zn2+ , Mg2+ , Mn2+ , Fe2+ , Cu2+ , K+ , Na+ ) или сложные органические соединения. Органические кофакторы обычно называют коферментами, некоторые из них являются производными витаминов. Тип связи между ферментом и коферментом может быть различным. Иногда они существуют отдельно и связываются друг с другом во время протекания реакции. В других случаях кофактор и фермент связаны постоянно и иногда прочными ковалентными связями. В последнем случае небелковая часть фермента называется простетической группой.
Некоторые коферменты
Кофермент |
Общая роль |
||||||
предшественник |
|||||||
NAD+ , NADP+ |
водорода |
Никотиновая кислота - |
|||||
(электронов) |
витамин РР |
||||||
водорода |
Рибофлавин - витамин |
||||||
(электронов) |
|||||||
Кофермент А |
Активация и |
Пантотеновая кислота |
|||||
ацильных групп |
||||||
Связывание СО2 |
||||||
Пиридоксальфосфат |
Перенос аминогрупп |
Пиридоксин - витамин |
||||
Тетрагидрофолиевая |
||||||
одноуглеродных |
Фолиевая кислота |
|||||
фрагментов |
||||||
Роль кофактора в основном сводится к следующему:
∙ изменение третичной структуры белка и создание комплементарности между ферментом и субстратом;
∙ непосредственное участие в реакции в качестве еще одного субстрата.
В этой роли обычно выступают органические коферменты. Их участие в реакции иногда сводится к тому, что они выступают как доноры или акцепторы определенных химических групп.
Механизмы действия ферментов
Первоначальным событием при действии фермента является его специфическое связывание с лигандом - субстратом (S). Это происходит в области активного центра, который формируется из нескольких специфических R-групп аминокислот, определенным образом ориентированных в пространстве.
Важнейшие аминокислотные остатки в активном центре лизоцима
У некоторых ферментов в активном центре располагается и кофактор. Одни R- группы активного центра принимают участие в связывании субстрата, другие - в катализе. Некоторые группы могут делать и то, и другое. Детальный механизм действия каждого фермента уникален, но есть общие черты в «работе» ферментов, которые заключаются в следующем: высокая избирательность действия фермента обеспечивается тем, что субстрат связывается в активном центре фермента в нескольких точках и это исключает ошибки; активный центр располагается в углублении (нише) поверхности фермента и имеет комплементарную субстрату конфигурацию. В результате субстрат окружается функциональными группами активного центра фермента и изолируется от водной среды. Связывание субстрата с ферментом часто вызывает конформационные изменения, что ведет к правильному (оптимальному) расположению аминокислотных остатков, требуемому для протекания катализа, и тем самым увеличивает специфичность фермент-
субстратного взаимодействия (индуцированное соответствие). Так как максимальная активность фермента обусловлена оптимальной конформацией молекулы фермента в целом и активного центра в частности, то даже небольшие изменения окружающих условий, которые затрагивают связывание субстрата или конформацию третичной структуры белка, будут влиять на скорость ферментативной реакции. Например, изменение рН приводит к изменению степени ионизации ионогенных групп фермента и, следовательно, ведет к перераспределению межрадикальных связей в третичной структуре. Оптимальное рН для каждого фермента означает некоторое оптимальное состояние его ионизации, соответствующее наилучшей комплементарности. Изменение температуры вызывает противоречивый эффект: с одной стороны, при повышении температуры до 37 - 40о скорость ферментативной реакции увеличивается, что закономерно для катализа; с другой стороны, при температуре более 50о начинается денатурация фермента.
Кинетика ферментативных реакций определяется образованием ферментсубстратного комплекса:
Где Е - фермент, S - субстрат, ES - ферментсубстратный комплекс, реакция образования которого обратима и характеризуется константами К1 и К-1 соответственно.
Распад фермент-субстратного комплекса протекает по уравнению первого порядка, он практически необратим и характеризуется константой скорости К2. Эта стадия процесса является более медленной, т.е. лимитирующей. Начальная скорость (Vo). При обычных условиях, когда [S] >> [E], начальная скорость прямо пропорциональна концентрации фермента. Максимальная скорость (Vmax). При фиксированной концентрации фермента, скорость реакции стремится к конечному максимальному значению, в то время как концентрация субстрата растет. Насыщение фермента субстратом наступает, когда весь фермент включен в фермент-субстратный комплекс. Константа Михаэлиса (Km). В случае, когда все активные центры заняты, и свободные молекулы фермента отсутствуют, Vo=Vmax. При таком условии говорят о 100% насыщении. При 50% насыщении, когда Vo=1/2 Vmax из уравнения Михаэлиса - Ментен следует: Vmax / 2 = Vmax [S] / Km + [S], или в преобразованном виде: Km + [S] = 2 [S]; Km = [S]. Следовательно, Km имеет размерность концентрации. Таким образом, Кm – это такая концентрация субстрата, которая необходима для связывания половины имеющегося фермента и достижения половины максимальной скорости. Из этого определения следует, что Km можно использовать для оценки сродства фермента по отношению к данному субстрату. Оценить субстратную специфичность можно по такому правилу: чем ниже значение Km, тем лучше (предпочтительнее) субстрат для данного фермента. Km и Vmax - кинетические параметры, отражающие механизмы действия фермента.
Кинетика ферментативных реакций
Vmax отражает эффективность действия фермента. Для сравнения каталитической активности различных ферментов необходимо выразить Vmax через количество каждого фермента. Такое преобразование приводит к величине, которую называют молярной активностью (или числом оборотов фермента). Она выражается числом моль субстрата, реагирующего с одним моль фермента за единицу времени. Активность фермента можно выразить также в единицах (ед. или Е) активности. Одна единица катализирует превращение субстрата со скоростью1 мкмоль /мин. Удельная активность - это активность в единицах, отнесённая к 1 мг белка.
Ингибиторы ферментов
Действие ферментов можно полностью или частично подавить (ингибировать) определенными химическими веществами (ингибиторами). По характеру действия ингибиторы могут быть обратимыми и необратимыми. В основе этого деления лежит прочность соединения ингибитора с ферментом. Другой способ деления ингибиторов основывается на характере места их связывания. Одни из них связываются с ферментом в активном центре, а другие - в удаленном от активного центра месте. Они могут связывать и блокировать функциональную группу молекулы фермента, необходимую для проявления его активности. При этом они необратимо, часто ковалентно, связываются с ферментом или фермент - субстратным комплексом и необратимо изменяют нативную конформацию. Это, в частности, объясняет действие Hg2+ , Pb2+ , соединений мышьяка. Ингибиторы такого рода могут быть полезны при изучении природы ферментативного катализа. Например, диизопропилфторфосфат ингибирует ферменты, имеющие серин в активном центре. Таким ферментом является ацетилхолинэстераза, катализирующая следующую реакцию:
Реакция происходит каждый раз после проведения нервного импульса, прежде чем второй импульс будет передан через синапс. Диизопропилфторфосфат - одно из отравляющих веществ нервно-паралитического действия, так как приводит к утрате способности нейронов проводить нервные импульсы.
Действие диизопропилфторфосфата на фермент
Терапевтическое действие аспирина как жаропонижающего и противовоспалительного средства объясняется тем, что аспирин ингибирует один из ферментов, катализирующий синтез простагландинов (ПГ). Простагландины - вещества, участвующие в развитии воспаления. Ингибирование обусловлено ковалентной модификацией одной из аминогрупп фермента - простагландинсинтетазы.
Взаимодействие аспирина с ферментом простагландинсинтетазой
Обратимые ингибиторы. Существует два типа подобных ингибиторов - конкурентные и неконкурентные. Конкурентный ингибитор конкурирует с субстратом за связывание с активным центром. Это происходит потому, что ингибитор и субстрат имеют сходные структуры:
Конкурентное ингибирование: S- субстрат, I- ингибитор (своей трехмерной структурой похож на субстрат).
В отличие от субстрата связанный с ферментом конкурентный ингибитор не подвергается ферментативному превращению. Более того, образование EI уменьшает число молекул свободного фермента, и скорость реакции снижается. Связывание S и I происходит взаимоисключающим образом. Образуется либо ES, либо EI, но не EIS. Так как конкурентный ингибитор обратимо связывается с ферментом, то можно сдвинуть
равновесие реакции E + I ↔ EI влево простым увеличением концентрации субстрата. Конкурентными ингибиторами являются многие химиотерапевтические средства. Например, сульфамидные препараты, используемые для лечения инфекционных болезней. Сульфаниламиды – это структурные аналоги парааминобензойной кислоты, из которой в клетке микроорганизма синтезируется кофермент (Н4 - фолат), участвующий в биосинтезе нуклеиновых оснований. Нарушение синтеза нуклеиновых кислот приводит к гибели микроорганизмов.
Неконкурентное обратимое ингибирование не может быть ослаблено или устранено повышением концентрации субстрата, так как эти ингибиторы присоединяются к ферменту не в активном центре, а в другом месте.
E + S ↔ ES → E + P; E + I ↔ EI; ES + I → ESI. Неконкурентное обратимое ингибирование
Связывание приводит к изменению конформации фермента и нарушению комплементарности к субстрату. Неконкурентные ингибиторы могут обратимо связываться как со свободным ферментом, так и с комплексом ES. Наиболее важными неконкурентными ингибиторами являются образующиеся в живой клетке промежуточные продукты метаболизма, способные обратимо связываться с определенными участками ферментов (аллостерические центры) и изменять их активность, что является одним из способов регуляции метаболизма. Исследование действия ингибиторов используется при изучении механизма действия фермента, кроме того, помогает в поисках более эффективных лекарственных средств, так как лечебное действие многих лекарств обусловлено тем, что они являются ингибиторами определенных ферментов. Структурные аналоги коферментов тоже могут быть ингибиторами. Кинетические тесты позволяют отличить конкурентное ингибирование от неконкурентного.
Зависимость I/V от I/S. 1 - без ингибитора, 2 - в присутствии ингибитора (а - конкурентное; б - неконкурентное ингибирование)
Регуляция действия ферментов
В живой клетке скорость ферментативных реакций находится под строгим контролем, что позволяет каждой метаболической цепочке реакций постоянно изменяться, приспосабливаясь к меняющимся потребностям клетки в продукте.
Метаболическая цепь: А, В, С, D - метаболиты, Е1, Е2, Е3, Е4 - ферменты
В каждой метаболической цепи есть фермент, который задает скорость всей цепочке реакций. Он называется регуляторным ферментом. Существует несколько способов регуляции действия ферментов:
∙ изменение активности фермента при его постоянной концентрации;
∙ изменение концентрации фермента, обычно в результате ускорения (индукции) или торможения (репрессии) синтеза фермента;
Основные способы регуляции активности ферментов
Аллостерическая регуляция . Фермент изменяет активность с помощью
нековалентно связанного с ним эффектора. Связывание происходит в участке, пространственно удаленном от активного (каталитического) центра. Это связывание вызывает конформационные изменения в молекуле белка, приводящие к изменению определенной геометрии каталитического центра. Активность может увеличиться - это активация фермента, или уменьшиться - это ингибирование.
Аллостерическая активация фермента
«Сообщение» о присоединении аллостерического активатора передается посредством конформационных изменений каталитической субъединице, которая становится комплементарной субстрату, и фермент «включается». При удалении активатора фермент вновь переходит в неактивную форму и «выключается». Аллостерическая регуляция является основным способом регуляции метаболических путей.
Регуляция активности ферментов путем фосфорилированиядефосфорилирования . Фермент изменяет активность в результате ковалентной модификации.
Регуляция активности липазы
В этом случае фосфатная группа - ОРО 3 2- присоединяется к гидроксильным группам
в остатках серина, треонина или тирозина. В зависимости от природы фермента фосфорилирование может его активировать или, наоборот, инактивировать. Реакция присоединения фосфатной группы и ее отщепление катализируют специальные ферменты - протеинкиназы и протеинфосфатазы.
Регуляция путем ассоциации-диссоциации субъединиц в олигомерном ферменте.
Этот процесс иногда начинается с ковалентной или нековалентной модификации одной из субъединиц. Например, фермент протеинкиназа в неактивной форме построена как тетрамер R2C2 (R и С - разные субъединицы). Активная протеинкиназа представляет собой субъединицу С, для освобождения которой необходима диссоциация комплекса. Активация фермента происходит при участии cAMP (циклоаденозинмонофосфорная кислота), которая способна присоединиться к субъединице R, после чего изменяется конформация, комплементарность субъединиц R и С и происходит диссоциация комплекса: R2C2 + 2cАМР 2С + 2(R -сАМР) Циклический АМР является продуктом АТР, превращение которой катализирует фермент аденилатциклаза: АТРс АМР + Н4 Р2 О7
Аденилатциклазная система . Аденилатциклаза и протеинкиназа катализируют взаимосвязанные реакции, которые составляют единую регуляторную систему.
Аденилатциклазная система
С помощью этой системы в клетку передаются сигналы из внеклеточной среды, и в нужном направлении изменяется метаболизм клетки. Внеклеточным вестником сигнала могут быть разные молекулы, в том числе и гормоны. Эти молекулы не проникают внутрь клетки, но «узнаются» мембранными рецепторами. При активации аденилатциклазы происходят следующие этапы:
∙ изменение конформации рецептора после присоединения к нему сигнальной молекулы и увеличение его сродства к регуляторному G-белку. В результате образуется комплекс рецептора и протомеров G-белка;
∙ образование этого комплекса приводит к изменению конформации a -протомера G- белка, который теряет сродство к GDP и происходит замена GDP на GTP. В результате комплекс протомеров G-белка распадается;
∙ a -протомер взаимодействует с аденилатциклазой, что ведет к изменению ее конформации и как следствие этого - активации;
∙ после этого аденилатциклаза катализирует синтез cAMP, который в свою очередь активирует cAMP-зависимую протеинкиназу. Активация последней связана с диссоциацией комплекса входящих в нее протомеров после присоединения cAMP. Протеинкиназа фосфорилирует соответствующие ферменты, изменяет их активность и, следовательно, скорость метаболизма в клетке.
Активация ферментов путем частичного протеолиза. Некоторые ферменты
синтезируются первоначально неактивными и лишь после секреции из клетки переходят в активную форму. Неактивный предшественник называется проферментом. Активация профермента включает модификацию первичной структуры с одновременным изменением конформации. Например, трипсиноген, синтезированный в поджелудочной железе, затем в кишечнике превращается в трипсин путем удаления фрагмента с N-конца: энтеропептидаза трипсиногентрипсин + Val-(Acn) -Lys Расщепление определенных пептидных связей «запускает» новые взаимодействия R-групп по всей молекуле, приводя к новой конформации, в которой R-группы активного центра занимают оптимальное положение для катализа. Нарушения структуры какого-либо фермента, ведущие к снижению его активности, приводят к нарушению метаболических путей, в которых участвует этот фермент. Такие нарушения почти всегда проявляются как болезни. Повреждения ферментов бывают двух типов: наследственные дефекты строения фермента и повреждения, вызванные попадающими в организм токсическими веществами, ингибирующими фермент.
Номенклатура и классификация ферментов
Номенклатура ферментов. На первых этапах развития энзимологии названия ферментам давали их первооткрыватели по случайным признакам (тривиальная номенклатура). Например, к тривиальным относятся названия ферментов: пепсин, трипсин, химотрипсин. Первая попытка ввести правило для названий ферментов была предпринята Е. Дюкло в 1898 г. (рациональная номенклатура). Согласно рациональной номенклатуре, простой фермент называли по названию субстрата с добавлением окончания -аза (ДНКаза, РНКаза, амилаза, уреаза). Для названия холофермента по рациональной номенклатуре использовали название кофермента (пиридоксальфермент, геминфермент). Позднее в названии фермента стали использовать название субстрата и тип катализируемой реакции (алкогольдегидрогеназа).
В 1961 г. V Международный биохимичекий конгресс, проходивший в Москве, утвердил научную номенклатуру ферментов. Согласно этой номенклатуре название фермента складывается из химического названия субстрата (субстратов), на который действует фермент, типа катализируемой реакции и окончания -аза. Например, фермент, осуществляющий гидролиз мочевины (рациональное название - уреаза), по научной номенклатуре называют карбамидамидогидролазой:
Если в химической реакции участвуют донор какой-либо группировки атомов и акцептор, то фермент называют следующим образом: химическое название донора, химическое название акцептора, тип катализируемой реакции. Например, фермент, катализирующий процесс переаминирования глутаминовой и пировиноградной кислот, называется глутамат: пируватаминотрансфераза.
Однако следует отметить, что наряду с названиями по научной номенклатуре допускается использование тривиальных названий ферментов.
Классификация ферментов. В настоящее время известно более 2000 ферментов. Все ферменты разделены на шесть классов, каждый из которых имеет строго определенный номер.
- Оксидоредуктазы катализируют окислительно-восстановительные процессы.
- Трансферазы катализируют реакции переноса функциональных групп и молекулярных остатков с одной молекулы на другую.
- Гидролазы катализируют реакции гидролиза.
- Лиазы катализируют реакции отщепления (кроме атомов водорода) с образованием двойной связи либо присоединения по двойной связи, а также негидролитический распад органических соединений либо синтез без участия макроэргических веществ.
- Изомеразы катализируют процессы изменения геометрической или пространственной конфигурации молекул.
- Лигазы катализируют реакции синтеза, сопровождающиеся гидролизом богатой энергией связи (как правило, АТФ).
Классы ферментов делятся на подклассы, а подклассы, в свою очередь, на подподклассы. Подкласс уточняет действие фермента, так как указывает в общих чертах на природу химической группы субстрата. Подподкласс еще более конкретизирует действие фермента, уточняя природу атакуемой связи субстрата или природу акцептора, который участвует в реакции.
Система классификации предусматривает для каждого фермента специальный шифр, состоящий из четырех кодовых чисел, разделенных точками. Первая цифра в шифре обозначает номер класса, вторая - номер подкласса, третья - подподкласса и четвертая - порядковый номер в данном подподклассе. Так, лактатдегидрогеназа имеет шифр КФ 1.1.1.27, т.е. относится к первому классу, первому подклассу, первому подподклассу и занимает 27-е место в перечне ферментов упомянутого подподкласса.
Приведем конкретные примеры биохимических процессов, катализируемых ферментами, относящимися к определенному классу и подклассу.
1. Оксидоредуктазы. Общая схема процессов, катализируемых оксидоредуктазами, может быть выражена следующим образом:
Наиболее часто мы будем встречать оксидоредуктазы подкласса оксидаз и дегидрогеназ, поэтому рассмотрим их подробнее.
Оксидазы - это оксидоредуктазы, которые переносят атомы водорода или электроны непосредственно на атомы кислорода либо внедряют в молекулу субстрата атом кислорода:
Дегидрогеназы - это оксидоредуктазы, катализирующие процесс отщепления атомов водорода.
Все дегидрогеназы являются холоферментами, коферментами которых служат следующие соединения: никотинамидаденинди-нуклеотид (НАД), никотинамидадениндинуклеотид (НАДФ), флавинмононуклеотид (ФМН), флавинадениндинуклеотид (ФАД), хиноны.
Наиболее распространены в природе дегидрогеназы, содержащие в качестве кофермента НАД:
Как видно из схемы, присоединение снятого с субстрата атома водорода происходит по ядру никотинамида. Механизм действия НАДФ такой же, как и НАД. НАД- и НАДФ-зависимые дегидрогеназы способны отщеплять атомы водорода от субстратов (спиртов, альдегидов,гидроксикислот, аминов и др.) в виде гидрид-ионов (Н -) и протонов (Н +), окисляя таким образом указанные соединения.
Примером процесса, катализируемого НАД-зависимой дегидрогеназой, может служить окисление молочной кислоты (лактата) до пировиноградной кислоты (пирувата):
Коферменты ФМН и ФАД содержат в своем составе фосфорилированный витамин В2 (рибофлавинфосфат), который способен отщеплять от субстрата два атома водорода:
Пример реакции, катализируемой ФАД-зависимой дегидрогеназой:
2. Трансферазы. Это один из самых многочисленных классов ферментов. В зависимости от характера переносимых групп выделяют фосфотрансферазы, аминотрансферазы, гликозилтрансферазы, ацилтрансферазы и др.
Фосфотрансферазы - это ферменты, катализирующие перенос остатка фосфорной кислоты. В результате действия фосфотрансфераз образуются фосфорные эфиры различных органических соединений, многие из которых обладают повышенной реакционной способностью и более легко вступают в последующие реакции. Следовательно, фосфорилирование органических соединений можно считать процессом их активации. Чаще всего донором фосфатных групп является молекула аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). Фосфотрансферазы, использующие в качестве донора фосфатной группы молекулу АТФ, называются киназами . К киназам относится, например, глицеролкиназа, ускоряющая перенос остатка фосфорной кислоты от молекулы АТФ к молекуле глицерина:
Аминотрансферазы ускоряют перенос аминогруппы. Аминотрансферазы - двухкомпонентные ферменты, коферментом которых служит пиридоксальфосфат (фосфорилированный витамин В 6).
Гликозилтрансферазы ускоряют реакции переноса гликозильных остатков, обеспечивая, главным образом, реакции синтеза и распада олиго- и полисахаридов. Если гликозильный остаток переносится на молекулу фосфорной кислоты, то процесс называется фосфоролизом , а ферменты, обеспечивающие этот процесс, называются фосфорилазами . В качестве примера приведем схему фосфоролиза мальтозы:
Донором гликозильных остатков в процессах синтеза олиго- и полисахаридов служат нуклеозиддифосфатсахара (НДФ-сахара), одним из представителей которых является уридиндифосфатглюкоза (УДФ-глюкоза):
Ацилтрансферазы катализируют процессы переноса ацилов (радикалов карбоновых кислот) на спирты, амины, аминокислоты и другие соединения. Источником ацилов является ацил-КоА, который можно рассматривать в качестве кофактора в реакциях переноса ацильных групп. Примером реакции трансацилирования может служить реакция синтеза фосфатидной кислоты, в которой участвует фосфоглицерин и две молекулы ацил-КоА:
3. Гидролазы. Эти ферменты ускоряют реакции гидролиза органических соединений; обязательным участником этих процессов является вода. В зависимости от характера гидролизуемой связи гидролазы подразделяют на ряд подклассов: эстеразы, гликозидазы, пептидгидролазы и др. Отличительной чертой всех гидролаз является то, что они являются однокомпонентными ферментами.
Эстеразы катализируют реакции гидролиза сложноэфирных связей. Приведем примеры:
Липаза ускоряет гидролиз внешних сложноэфирных связей в молекуле триглицерида. Особенно широко распространены эстеразы, катализирующие гидролиз сложных эфиров фосфорной кислоты и углеводов. Эти ферменты называются фосфатазами :
Гликозидазы ускоряют реакции гидролиза гликозидных связей. Примером гликозидазы может служить мальтаза (α -глюкозидаза).
Из гликозидаз, действующих на полисахариды, наиболее распространены амилазы .
Пептид-гидролазы. Ферменты этого подкласса катализируют гидролиз пептидных связей в молекулах пептидов и белков, что можно выразить следующей схемой:
Пептид-гидролазы гидролизуют не все пептидные связи в молекулах белков и пептидов, а только определенные. О специфичности действия пептид-гидролаз речь пойдет в главе "Обмен белков".
Амидазы ускоряют гидролиз амидов дикарбоновых аминокислот - аспарагина и глутамина.
4. Лиазы. Ферменты этого класса катализируют разнообразные реакции распада и синтеза. В зависимости от того, какая связь расщепляется или, наоборот, образуется, выделяют углерод-углерод, углерод-кислород, углерод-азот лиазы. Приведем примеры процессов, катализируемых ферментами указанных подклассов.
Углерод-углерод лиазы. В природе широко представлены ферменты, ускоряющие декарбоксилирование кето- и аминокислот. Декарбоксилазы или карбокси-лиазы - двухкомпонентные ферменты, коферментом которых является фосфорный эфир витамина B 1 - в случае декарбоксилирования кетокислот и витамина В 6 - в случае декарбоксилирования аминокислот. Схемы процессов представлены ниже:
Углерод-кислород лиазы (гидролиазы). Ферменты этого подкласса ускоряют реакции гидратации и дегидратации органических соединений.
Эти реакции постоянно идут при распаде и синтезе углеводов и жирных кислот, поэтому гидратазы играют большую роль в жизнедеятельности организмов. Примером может служить фумаратгидратаза, присоединяющая молекулу воды к кратной связи фумаровой кислоты:
Углерод-азот лиазы катализируют реакции прямого дезаминирования некоторых аминокислот; примером может служить аспартат-аммиак-лиаза:
5. Изомеразы. Изомеразы ускоряют процессы превращений одних изомеров органических соединений в другие. Приведем два примера:
6. Лигазы (синтетазы). Ферменты этого класса обеспечивают синтез различных органических соединений. Характерной чертой ферментов этого класса является использование соединений, способных поставлять энергию для осуществления биосинтеза. Одним из таких соединений является аденозинтрифосфорная кислота - АТФ. В качестве примера действия лигазы можно привести синтез щавелевоуксусной кислоты из пировиноградной путем ее карбоксилирования:
Следует обратить внимание на тот факт, что молекула АТФ не участвует в образовании продуктов реакции, а просто распадается до АДФ и Н 3 РО 4 ; при этом освобождается энергия, необходимая для осуществления биосинтеза.
Важной реакцией является образование ацил-коэнзима А (ацил-КоА), которая тоже ускоряется ферментом, относящимся к рассматриваемому классу:
Субстрат (S) - вещество, химические превращения которого в продукт (Р) катализирует фермент (Е).
S + E --> P, фермент снижает энергию активации; за счет этого реакция ускоряется.
Активный центр фермента - участок поверхности молекулы фермента, непосредственно взаимодействующий с молекулой субстрата. Образован из остатков аминокислот, находящихся в составе различных участков полипептидной цепи или различных полипептидных цепей, пространственно сближенных. Возникает на уровне третичной структуры белка-фермента.
В его пределах различают три области:
1) каталитический центр - область (зона) активного центра фермента, непосредственно участвующая в химических преобразованиях субстрата. Формируется за счет радикалов 2–3 аминокислот, расположенных в разных местах полипептидной цепи фермента, но пространственно сближенных между собой за счет изгибов этой цепи. Если фермент - сложный белок, то в формировании каталитического центра нередко участвует простетическая группа молекулы фермента - кофермент (например, все водорастворимые витамины и жирорастворимый витамин K);
2) адсорбционный центр - участок активного центра молекулы фермента, на котором происходит сорбция (связывание) молекулы субстрата. Формируется 1, 2, чаще 3 радикалами аминокислот, расположенными рядом с каталитическим центром. Главная функция - связывание молекулы субстрата и передача этой молекулы каталитическому центру в наиболее удобном положении (для каталитического центра). Сорбция происходит только за счет слабых типов связей и потому обратима. По мере формирования этих связей происходит конформационная перестройка адсорбционного центра, которая приводит к более тесному сближению субстрата и активного центра фермента, более точному соответствию между их пространственными конфигурациями. Именно структура адсорбционного центра определяет субстратную специфичность фермента;
3) аллостерические центры - такие участки молекулы фермента вне его активного центра, которые способны связываться слабыми типами связей (значит - обратимо) с тем или иным веществом (лигандом). Это связывание приводит к такой конформационной перестройке молекулы фермента, которая распространяется и на активный центр, облегчая либо затрудняя (замедляя) его работу. Соответственно такие вещества называются аллостерическими активаторами, или аллостерическими ингибиторами данного фермента. Аллостерические центры найдены не у всех ферментов.
-
Строение ферментов фермент (Е). -
Строение ферментов . Субстрат (S) - вещество, химические превращения которого в продукт (Р) катализирует фермент . (Ферменты как биологические катализаторы. -
Субстратная специфичность - способность фермента катализировать превращения только одного определенного субстрата или же группы сходных по строению субстратов. -
Разберем их строение на примере молекулы IgG.
Классификация белков-ферментов плазмы крови: 1) ферменты плазмы - выполняют специфичные метаболические функции в плазме. -
Строение молекулы белка. макромолекулы белка имеют вид шариков (глобул). каждому
Номенклатура и классификаия ферментов ,В настоящее время известно более 2400 ферментов . -
Строение ядра: В состав ядра входит ядерная оболочка(нуклеоплазма) содержащая хроматин и ядрышки.
Нуклеоплазма содержит белки, ферменты , нуклеотиды, ионы и т.д. Функции ядра... -
Используя знания о строении и функциях пищеварительной системы, раскройте роль ферментов в пищеварении, назовите профилактику пищевых отравлений, кишечных инфекций.