Методы исследования гистологии. Методы гистологического исследования

Методы исследования в гистологии включают приготовление гистологических препаратов и их изучение с помощью световых или электронных микроскопов. Гистологические препараты представляют собой мазки, отпечатки органов, пленочные препараты, тонкие срезы кусочков органов, окрашенные тем или иным красителем (исследуются также нативные - неокрашенные срезы), помещенные на предметное стекло, заключенные в бальзам и покрытые тонким покровным стеклом.

Для изготовления гистологического препарата необходимо после взятия материала произвести его фиксацию в том или ином фиксаторе (формалине, спирте, а для электронной микроскопии - в глутаровом альдегиде и четырехокиси осмия). Делается это для предотвращения процессов аутолиза и сохранения структуры органа, близкой к прижизненной. Далее следуют этапы обезвоживания кусочка органа в спиртах возрастающей концентрации и в ксилоле с целью уплотнения тканей, что необходимо для изготовления тонких срезов. Для придания кусочку органа еще большей плотности и гомогенности, обеспечивающей высококачественную резку, проводят его заливку в органическую среду - парафин, целлоидин (для световой микроскопии) и органические смолы (эпон, аралдит, дуркупан) - для электронно-микроскопического исследования.

Существуют также физические способы фиксации материала , наиболее распространенным из которых является быстрое замораживание кусочка органа с помощью жидко.го азота и других средств. Для резки замороженного материала используют специальные приборы - криостаты, или замораживающие микротомы.

Толщина срезов, предназначенных для световой микроскопии , не должна превышать 4-5 мкм, для электронной - 50-60 нм (такие ультратонкие срезы изготавливают на специальном приборе ультратоме, используя стеклянные или алмазные ножи и автоматический режим резки).

После получения срезов их помещают на предметные стекла, далее следуют этапы освобождения срезов от заливочной среды (при световой микроскопии) и окраски для придания срезам контрастности. Среди гистологических красителей наиболее часто употребляется сочетание гематоксилина, маркирующего ядро (кислотные молекулы), и эозина, избирательно окрашивающего белковые молекулы (цитоплазматический краситель).

По окончании окрашивания срезы заключают в консервирующие среды (канадский, кедровый бальзамы) и накрываются покровным стеклом.

Основным методом гистологического исследования клеток, тканей и органов является световая микроскопия. В световом микроскопе для освещения объекта используются лучи видимого спектра. Современные световые микроскопы позволяют получать разрешение порядка 0,2 мкм (разрешающая способность микроскопа - это то наименьшее расстояние, при котором две рядом расположенные точки видны как отдельные). Разновидности световой микроскопии - фазово-контрастная, интерференционная, поляризационная, темнопольная и др.

Фазово-контрастная микроскопия - метод изучения клеток в световом микроскопе, снабженном фазово-контрастным устройством. Благодаря смещению фаз световых волн в микроскопе такой конструкции повышается контрастность структур исследуемого объекта, что позволяет изучать живые клетки.

Интерференционная микроскопия . В интерференционном микроскопе падающие на объект световые пучки раздваиваются - один пучок проходит через объект, другой - идет мимо. При последующем воссоединении пучков возникает интерференционное изображение объекта. По сдвигу фаз одного пучка относительно другого можно судить о концентрациях различных веществ в исследуемом объекте.

Поляризационная микроскопия . В микроскопах этого типа световой пучок разлагается на два луча, поляризованных во взаимно перпендикулярных плоскостях. Проходя через структуры ткани со строгой ориентацией молекул, лучи запаздывают друг относительно друга вследствие неодинакового их преломления. Возникающий при этом сдвиг фаз является показателем двойного лучепреломления клеточных структур (таким способом были исследованы, например, миофибриллы).

Злокачественные новообразования — это группа заболеваний, насчитывающая несколько тысяч видов опухолей разных типов и разной степени злокачественности. Они подразделяются на большие группы в зависимости от того из каких тканей они развиваются: если из эпителиальных (барьерных) — то это раки, если из соединительных тканей (мягких тканей и костей) – саркомы, если из лимфоидных (иммунных) – лимфомы/лейкозы. От того насколько правильно верифицирована опухоль (определен ее тип, степень злокачественности и другие характеристики) зависит правильность и эффективность лечения. Важную роль в этом играют гистологические исследования .

О том, как проходят гистологические исследования, какие задачи кроме диагностических они позволяют решать, что влияет на сроки их выполнения рассказывает заведующая патологоанатомическим отделением с прозектурой НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова, к.м.н. Анна Сергеевна Артемьева.

Что служит материалом для патоморфологических (гистологических) исследований?

Кусочек ткани пациента: кожи, слизистых оболочек, внутренних органов, костей, головного и спинного мозга и т.п., так называемый биоптат.

Процесс получения фрагмента ткани (биоптата) — биопсия – это несколько разных способов забора материала для гистологического исследования.

Виды биопсии:

  • Пункционная биопсия – «тычок», тонкой или толстой иглой. Пункционные биоптаты редко имеют диаметр больше 1-2 мм.
  • Ножевая биопсия – открытая или эндоскопическая (малоинвазивная), в том числе лапароторако-медиастиноскопия.

Биопсию внутренних органов делают под УЗИ-навигацией, либо с помощью хирургического вмешательства.

Операционный материал – это все что удалено во время операции, как правило, орган или его часть, или несколько органов и/или их частей с образованием (опухолью) или без него.

Как обрабатывают эти материалы для проведения гистологического исследования?

1 Этап. Фиксация — «консервирование» биоптата в формалине — специальном химическом растворе, который предотвращает гниение, позволяет сохранить структуры ткани.

Фиксация биоптата может занимать от 6 до 24 часов – в зависимости от его вида и размера.

Операционный материал фиксируется дольше, в несколько этапов. Сначала предварительная фиксация, которая занимает примерно 12 часов. Затем вырезка нужных фрагментов и повторная фиксация еще 24 часа.

Соотношение объема материала к объему формалина должно быть 1:20.

Время фиксации сократить нельзя!

2 Этап. Процессинг — процесс обезвоживания, обезжиривания и пропитки материала парафином. Автомат перемещает кусочек материала из раствора в раствор.

В качестве растворов применяются: абсолютированный изопропиловый спирт (6-8 смен), ксилол (2 смены), расплавленный парафин (2 смены).

Программа разнится для «жирного» материала (к которым относятся, например, ткани молочной железы) и «нежирного» – 36 и 24 часа соответственно.

Процесс получения парафиновых блоков.

3 Этап. Изготовление парафинового блока. Кусок материала помещается в форму с расплавленным парафином (уже другим нежели во время процессинга – с более высокой температурой плавления) и охлаждается. Выполняется вручную, сложно ускорить.

Микротомия

4 Этап. Изготовление срезов. Толщина образца — кусочка ткани, залитого в парафин – 1-3 мм. Толщина каждого среза 4-5 мкм (0,004-0,005 мм). Выполняет лаборант с использованием специального инструмента – микротома.

Срезы монтируются на стекла и должны высохнуть.

Несмотря на то, что часть материала теряется при выравнивании в микротоме, при должном профессионализме, из одного образца — материала от одной биопсии, операционного материала от одной опухоли, возможно изготовить около 100 стекол (микропрепаратов).

Для чего делаются срезы?

Срезы делаются для рутинной окраски гематоксилинном и эозином, иммуногистохимического исследования и других видов исследований.

Срезы для всех исследований используются одинаковые, различается окраска, могут отличаться стекла, на которые они монтируются, так для ИГХ и FISH нужны специальные адгезивные стекла или заряженные стекла.

Гистостейнер

Блоки и стекла способны храниться долгие годы и использоваться для проведения дополнительных гистологических исследований, пересмотров, а также в научных целях.

Архив

Архив гистологических материалов собирается в НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова с 1927 года и содержит более 10 млн единиц хранения (микропрепараты — стекла, парафиновые блоки, архивные карточки, влажный архив).

Какие виды гистологических исследований наиболее информативны?

  • Гистологическое исследование
  • Иммуногистохимия (ИГХ)
  • Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), может быть хромофобной (принцип тот же, другой тип метки)

Что позволяют определить разные виды гистологических исследований

Гистологическое исследование – что это такое?

Позволяет верифицировать опухоль – то есть определить из каких клеток она состоит (из какой ткани она развивается), степень ее дифференцировки (зрелости).

Рутинная окраска, выполняющаяся при гистологическом исследовании, позволяет выявить патологический процесс в анализируемом материале (биоптате, операционном материале):

  • воспаление,
  • специфическое воспаление,
  • аномалия развития,
  • опухоль.

Также, в большинстве случаев, благодаря рутинной окраске, можно определить степень злокачественности опухоли и, если она достаточно зрелая, то какова ее природа.

Окрашенные срезы под микроскопом


Инвазивный протоковый рак er 100%.


Карцинома сигмовидной кишки.


Крупноклеточная нейроэндокринная опухоль.


МТС крупноклеточной нейроэндокринной опухоли.


Неспецифический рак молочной железы. Участок in situ карциномы внутри протока, криброзного типа.

Низкодифферинцированный рак пищевода.

При гистологическом исследовании биоптата и операционного материала можно оценить распространенность: размер опухоли и прорастание в окружающие ткани, насколько затронуты лимфоузлы и есть ли метастазы в отдаленные органы (если эти все структуры присланы для гистологического исследования). При консультации готовых микропрепаратов – стекол, это, как правило, невозможно, если опухоль больше размеров гистологической кассеты или рассечена предыдущим исследователем и не предоставлены данные макроскопического исследования.

Во время гистологического исследования изучаются все стекла от одного образца – материала, полученного от одного вмешательства — одной операции или одной биопсии, вне зависимости от их количества, это считается одной консультацией.

Сроки выполнения гистологического исследования зависят от количества микропрепаратов и от категории сложности того процесса, который в них обнаруживается, сроки могут удлиняться, особенно при необходимости использования дополнительных методов исследования и анализа дополнительных сведений. На сроки выполнения гистологического исследования влияет полнота предоставленной пациентом клинической информации, в том числе данных уже проведенных исследований.

Иммуногистохимия (ИГХ)

Сложное многоэтапное исследование, выполняется после гистологического исследования на том же материале. Опухолевые срезы окрашиваются антителами, которые способны связываться антигенами (белками), которые несут опухолевые клетки. Разные опухолевые клетки несут разные антигены, к каждому из которых подобно ключа к замку подходит антитело.

Один из этапов ИГХ

ИГХ исследование - это комбинаторика. 100% специфичных и чувствительных к какой-то опухоли маркеров не существует, но есть набор антигенов, которые в определенном типе опухоль должны быть и набор тех, которых там быть не должно, таким образом ИГХ-панель строится так чтобы включать несколько антител, которые должны быть позитивны и несколько, которые должны быть негативны. Для разных опухолей различаются эти наборы позитивных/негативных маркеров.

При проведении прогностической ИГХ – выявлении маркеров чувствительности к терапии определяется набор таких маркеров для конкретных опухолей, например, рака молочной железы: рецепторы стероидных гормонов (эстроген, прогестерон), рецептор эпидермального фактора роста (HER2) и индекс пролиферативной активности Ki67 (скорости деления клеток).

Стекла окрашиваются последовательно — различными антителами красятся наборы маркеров в несколько этапов, процесс окраски стекол одним антителом занимает 48 часов.

Таким образом, каждое антитело наносится на отдельный срез ткани, монтированный на отдельное стекло, как правило с соответствующим внешним контролем, количество реакций (используемых антител) и этапов окраски может существенно варьировать в зависимости от конкретной диагностической ситуации, все зависит от индивидуальных особенностей опухоли. Проводится такое количество окрасок, которое необходимо для того, чтобы выявить наиболее характерный для определенной опухоли набор позитивных и негативных маркеров.

Кому-то для этого будет достаточно 5 антител, а кому-то необходимо сделать 20 окрасок и более. Максимальное количество окрасок, которое нам приходилось делать – 212.

Поэтому точные сроки и стоимость этого исследования невозможно определить заранее. Разные по течению и прогнозу опухоли могут быть очень похожи друг на друга, только минимальные различия в окрашивании, с учетом клинических данных и данных других методов обследования, могут позволить установить верный диагноз.

Есть целый ряд доброкачественных опухолей, симулирующих злокачественные, в том числе высокоагрессивные, а некоторые злокачественные высоко дифференцированные опухоли трудно отличить от воспалительных и реактивных процессов. В таких ситуациях только опыт и квалификация патоморфолога, анализ всего комплекса доступной информации (снимки КТ, МРТ, рентген, протокол операции, и др.) позволяют поставить диагноз.

В грамотной интерпретации результатов ИГХ очень важна роль эксперта, ведь те случаи, с которыми приходится работать, в большинстве своем, сложные. Практически не существует антител, которые могут выступать в качестве 100%-х маркеров той или иной опухоли, врачу всегда приходится взвешивать различные вероятности.

Что определяется с помощью ИГХ?

  • Наличие рецепторов гормонов прогестерона и эстрогена при раке молочной железы ;
  • Экспрессию HER-2/neu в клетках при раке молочной железы, раке желудка ;
  • Определить ходжкинские и неходжкинские лимфомы — установить точный диагноз лимфомы на сегодняшний день невозможно без применения этого вида исследования.
  • Определить первичная это опухоль или метастазы, тканевую принадлежность метастазов.

Иммуногистохимия позволяет оценить потенциальный темп роста опухоли, ответ на химио-, таргетную, гормональную терапию.

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH-тест)

Это метод молекулярно-генетической диагностики в ткани.

FISH проводится в срезе ткани и позволяет привязать генетическую перестройку к конкретной опухолевой клетке.

В этом тесте также используются специальные красители, которые связываются только с определенными участками хромосом. Их называют зондами, которые могут быть помечены флуоресцентным или хромогенным красителем, визуализирующимися при помощи флуоресцентного или светового микроскопа.

Технические операции по подготовке гистологических стекол к этому исследованию занимает 2 рабочих дня.

Анализ препарата с помощью многоголового микроскопа.

Полученные микропрепараты очень чувствительны к внешней среде – они могут выцвести со временем, чтобы избежать потерь информации все FISH-препараты сканируются, создается их цифровая копия, которая доступна для внешнего пересмотра. Специалисты просматривают флуоресцирующий материал в темном поле, в анализе препарата принимают участие как минимум 2 специалиста. При необходимости используется и цифровой анализ.

Что определяется с помощью FISH-теста?

FISH-тест позволят диагностировать некоторые виды опухолей, определяет целесообразность использования некоторых химиотерапевтических препаратов.

  • определяется наличие амплификации HER2 в случаях пограничного результата по данным ИГХ, что необходимо для назначения таргетной терапии;
  • проводится диагностика, то есть выявление генетических перестроек специфичных для определенного типа опухолей, когда невозможно окончательно установить диагноз при помощи более простых методик, чаще всего это саркомы мягких тканей и опухоли головного мозга;
  • генетические отклонения, вызывающие рак того или иного органа;
  • при лимфомах эта методика используется в диагностических целях и для выявления факторов неблагоприятного прогноза, то есть показаний для ранней интенсификации лечения.

Проведение гистологического исследования, и в первую очередь FISH-теста — это экспертная работа, которая зависит от квалификации специалиста. Очень многие мутации, которые выявляются в опухолях, не всегда являются метками опухолей, они могут находиться и в доброкачественных образованиях или нормальных тканях.

За год патологоанатомическое отделение НМИЦ онкологии имени Н.Н. Петрова выполняет около 20000 гистологических исследований (пациентов), из них около 5000 консультативных случаев (пересмотров), более 30000 ИГХ исследований, а также участвует в программе внешнего контроля качества ИГХ исследований NordIQ.

Специалисты отделения обладают огромным опытом проведения гистологических исследований и экспертными компетенциями.

Помните! Гистологические исследования – это отправная точка, от того насколько грамотно они выполнены зависит точность поставленного диагноза и эффективность назначенного лечения.

Скорость выполнения гистологических исследований и адекватность гистологического заключения зависят от ряда факторов:

  • Качества стекол и блоков;
  • Комплектности предоставления стекол (необходимо предоставить все стекла и блоки);
  • Предоставление пациентом дополнительной информации, которая поможет верно интерпретировать данные гистологического исследования, ИГХ и FISH-теста, а именно: данные анамнеза заболевания, данные о сопутствующих заболеваниях, в первую очередь инфекционных (ВИЧ, гепатиты); все данные всех проведенных обследований и вмешательств: снимки — рентген, КТ, МРТ, УЗИ, протоколы операций, выписки.

После выполнения гистологического исследования пациент получает гистологическое заключение/протокол исследования гистологического материала.

Расшифровка гистологического исследования: на что обратить внимание?

Гистологическое заключение включает в себя несколько рубрик (полей):

Макроскопическое описание

Заполняется как для биоптатов — не обязательно, так и для операционного материала, для которого имеет крайне важное значение в ряде случаев.

Микроскопическое описание

Описание изменений на микроскопическом уровне, не обязательно к заполнению, так как вся необходимая информация может быть отражена в поле «заключение».

Результаты иммуногистохимического исследования

В этом поле описано какие антитела использовались в данном случае и каков результат окрашивания: наличие окрашивание или его отсутствие, локализация в клетке при необходимости, а также процент позитивных клеток и интенсивность реакции, когда это имеет значение.

Патологоанатомическое заключение

Содержит нозологическую/классификационную единицу, если ее возможно установить по исследованному материалу, то есть дает ответы на вопросы:

  • Это первичная опухоль или метастаз?
  • Где локализован первичный опухолевый очаг?
  • Каков гистологический тип опухоли (из клеток какого типа она состоит).

Также приводятся все необходимые прогностические данные: степень дифференцировки, параметры, влияющие на стадию, состояние краев резекции, если возможно их оценить и т.п.

Поле может содержать комментарии, относительно возможного направления дальнейшего обследования, вероятности того или иного диагноза, необходимости ознакомиться с теми или иными клиническими данными и др.

Мы не рекомендуем пациентам самостоятельно заниматься расшифровкой показателей гистологического исследования, используя информацию, полученную на различных Интернет-сайтах и форумах пациентов, так как на интерпретацию данных влияет большое количество факторов, в том числе, возраст пациента, данные других исследований и др.

Расшифровкой исследования может заниматься только специалист – врач онколог по профилю заболевания!


Что вам необходимо сделать

  1. Если вы хотите узнать побольше о бесплатных возможностях ФБГУ НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова Минздрава России, получить очную или заочную консультацию по диагностике и лечению, записаться на приём, ознакомьтесь с информацией на официальном сайте .
  2. Если вы хотите общаться с нами через социальные сети, обратите внимание на аккаунты в

Гистологические методы исследования

применяются для изучения строения и функции клеток и тканей человека, животных и растительных организмов в норме, патологии и эксперименте. Основой Г. м. и. является - комплекс методических приемов, используемых при изготовлении препаратов клеток и тканей для их микроскопического исследования. Микроскопическое изучение клеток и тканей может проводиться двумя основными путями в зависимости состояния исследуемого объекта: исследование живых клеток и тканей, исследование неживых клеток и тканей, сохраняющих структуру благодаря специальным приемам фиксации.

Изучение живых объектов - витальное (суправитальное) - дает возможность наблюдать физиологические процессы в клетках и тканях, их прижизненное строение. Оно проводится на клетках, свободно взвешенных в жидкой среде (клетках крови, эпителиальных клетках соскобов и др.), а также на культурах клеток и тканей, выращенных на специальных питательных средах. Объектом прижизненного наблюдения могут быть тонкие, прозрачные тканевые пленки ( , плавательная перепонка). В экспериментальных исследованиях используется метод биологических окон (вживление прозрачных камер) и изучение тканевых имплантатов в естественной прозрачной среде, например в передней камере глаза животных. В зависимости от поставленной задачи при витальных исследованиях применяются различные специальные методы микроскопии: темнопольная, фазово-контрастная, флюоресцентная, поляризационная, ультрафиолетовая. Витальные гистологические методы применяются в основном для биологических и медико-биологических исследований. Их широкое применение ограничено большими техническими трудностями, связанными со свойствами переживающих тканей. В медицинских исследованиях, особенно в практике патолого-анатомических лабораторий, используются методы исследования фиксированных объектов.

Цель фиксации сохранить прижизненную структуру клеток и тканей путем быстрого воздействия на них химическими агентами, предотвращающими развитие посмертных изменений. Выбор метода фиксации зависит от задач исследования и особенностей фиксируемого материала. Так, для выявления тонких клеточных структур применяют фиксирующие смеси, содержащие соли тяжелых металлов (например, сулему) Лучшим фиксатором для цитологических целей служит четырехокись осмия, часто используемая и электронной микроскопии. Универсальным фиксатором является формальдегид, применяемый в виде 10% раствора формалина. Чтобы была равномерной и полной, кусочки ткани должны быть небольшими, а объем фиксирующей жидкости - во много раз превосходить объем фиксируемого материала. По окончании фиксации кусочки обычно промывают в воде или спирте. Твердые компоненты тканей (например, отложения солей кальция) удаляют с помощью методов декальцинации.

Наиболее быстрым и простым способом приготовления среза ткани, применяемым обычно при экспресс-диагностике, является кусочка и получение срезов ткани на замораживающем микротоме. Однако при этом трудно получить достаточно тонкие срезы, а также срезы с мелких объектов и распадающихся тканей. Поэтому кусочки тканей, как правило, заливают в уплотняющие среды - или целлоидин. Фиксированную обезвоживают в спиртах возрастающей крепости, проводят через промежуточный растворитель (ксилол или для парафина, спирт-эфир для целлоидина) и пропитывают парафином или целлоидином. в парафин позволяет получить более тонкие срезы (от 5-8 до 1-2 мкм ), чем в целлоидин. Срезы для микроскопического исследования приготавливают с помощью санного или роторного микротомов. Сверхтонкие срезы (толщиной от 90-100 до 5-15 нм ), необходимые для электронно-микроскопических исследований, готовят на ультратоме. Ультратомы используют и в световой микроскопии для получения полутонких срезов. Приготовленные срезы окрашивают для четкого выделения структур клеток и тканей, которые по-разному воспринимают красители. Основные красители - красящие основания и их соли ( , толуидиновый синий, азуры, бисмарк коричневый) - окрашивают так называемые базофильные структуры (ядра клеток, соединительной ткани). Кислые красители - красящие кислоты и их соли (пикриновая кислота, эритрозин) - окрашивают ацидофильные, или оксифильные, структуры (цитоплазму клеток, коллагеновые, эластические волокна). окраски следует отличать импрегнацию - специальный метод, основанный на определенных участков клеток и тканей восстанавливать тяжелые металлы (например, серебра, золота, осмия) из их солей и за счет этого приобретать интенсивную окраску.

Приготовление гистологического препарата завершается заключением его в среды, обеспечивающие сохранность структур объекта, его окраски и прозрачности. Наиболее часто для этих целей применяют органические смолы, например .


1. Малая медицинская энциклопедия. - М.: Медицинская энциклопедия. 1991-96 гг. 2. Первая медицинская помощь. - М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. - М.: Советская энциклопедия. - 1982-1984 гг .

Смотреть что такое "Гистологические методы исследования" в других словарях:

    Методические подходы и методы исследования в анатомии человека - Иногда приходится слышать о том, что в анатомии уже ничего не осталось для изучения, исследования, якобы все темы исчерпаны, все, что можно было изучать, уже изучено, все вопросы решены. Как будто бы все, что касается строения тела человека,… … Словарь терминов и понятий по анатомии человека

    ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. см. ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. Важнейшим условием получения достоверных результатов исследований является правильный выбор объектов анализа, своевременный их отбор и формулировка задачи исследования. Правила отбора проб … Болезни рыб: Справочник

    I Медицина Медицина система научных знаний и практической деятельности, целями которой являются укрепление и сохранение здоровья, продление жизни людей, предупреждение и лечение болезней человека. Для выполнения этих задач М. изучает строение и… … Медицинская энциклопедия

    Способы изучения различных объектов с помощью микроскопа. В биологии и медицине эти методы позволяют изучать строение микроскопических объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза человека. Основу М.м.и. составляет… … Медицинская энциклопедия

    - (гистологическое cytus клетка + греч. logos учение) основано на изучении с помощью микроскопа особенностей строения клеток, клеточного состава органов тканей, жидкостей организма человека и животных в норме и при патологических процессах. Ц. и.… … Медицинская энциклопедия

    I Гистология (греч. histos ткань + logos учение) медико биологическая наука, изучающая эволюцию тканей, их развитие в организме (гистогенез), строение, функции и взаимодействие у многоклеточных животных и человека. Основной предмет изучения Г.… … Медицинская энциклопедия

    I Вульва (vulva; pudendum femininum) наружные женские половые органы (по Международной анатомической номенклатуре женская половая область). Анатомия и физиология. Вульва (рис. 1) расположена снаружи от лобковых костей таза и прикрепленной к ним… … Медицинская энциклопедия

    Изучая изменения, вызванные в организме различными болезненными процессами, имеет целью присущими ей методами исследования как определение этих болезненных процессов, так и значение их по отношению к клинической картине болезни и смертельному… … Энциклопедический словарь Ф.А. Брокгауза и И.А. Ефрона

    I Биопсия (греч. bios жизнь + opsis зрение, зрительное восприятие) прижизненное взятие тканей, органов или взвеси клеток для микроскопического исследования с диагностической целью, а также для изучения динамики патологического процесса и влияния… … Медицинская энциклопедия

    Наука, занимающаяся изучением тканей животных. Тканью называют группу клеток, сходных по форме, размерам и функциям и по продуктам своей жизнедеятельности. У всех растений и животных, за исключением самых примитивных, тело состоит из тканей,… … Энциклопедия Кольера

    - (от греч. ἱστός ткань и греч. λόγος знание, слово, наука) раздел биологии, изучающий строение тканей живых организмов. Обычно это делается рассечением тканей на тонкие слои и с помощью микротома. В отличие от анатомии,… … Википедия

Книги

  • Множественная миелома и плазмоклеточные заболевания , Рамасами Картик, Лониал Сагар. В книге представлены основные клинические аспекты множественной миеломы и других плазмоклеточных заболеваний. Описаны лабораторные исследования, патогенез, диагностика и лечение. Во втором…

2. Объекты исследования гистологии

3. Приготовление гистологических препаратов

4. Методы исследования

5. Исторические этапы развития гистологии

1. Гистология наука о микроскопическом и субмикроскопическом строении, развитии и жизнедеятельности тканей животных организмов. Следовательно, гистология изучает один из уровней организации живой материи тканевой. Различают следующие иерархические уровни организации живой материи:

    клеточный;

    тканевой;

    структурно-функциональные единицы органов;

    органный уровень;

    системный уровень;

    организменный уровень

Гистология, как учебная дисциплина , включает в себя следующие разделы: цитологию, эмбриологию, общую гистологию (изучает строение и функции тканей), частную гистологию (изучает микроскопическое строение органов).

Основным объектом изучения гистологии является организм здорового человека и потому данная учебная дисциплина именуется как гистология человека.

Основная задача гистологии состоит в изучении строения клеток, тканей, органов, установления связей между различными явлениями, установление общих закономерностей.

Гистология, как и анатомия, относится к морфологическим наукам, главной задачей которых является изучение структур живых систем. В отличие от анатомии, гистология изучает строение живой материи на микроскопическом и электронно-микроскопическом уровне. При этом, изучение строения различных структурных элементов проводится в настоящее время с учетом выполняемых ими функций. Такой подход к изучению структур живой материи называется гистофизиологическим, а гистология нередко именуется как гистофизиология. Кроме того, при изучении живой материи на клеточном, тканевом и органном уровнях рассматривается не только форма, размеры и расположение интересующих структур, но методом цито- и гистохимии нередко определяется и состав веществ, образующих эти структуры. Наконец, изучаемые структуры обычно рассматриваются с учетом их развития, как во внутриутробном (эмбриональном) периоде, так и на протяжении постэмбрионального онтогенеза. Именно с этим связана необходимость включения эмбриологии в курс гистологии.

Гистология, как любая наука, имеет свои объекты и методы их изучения. Непосредственными объектами изучения являются клетки, фрагменты тканей и органов, особым способом приготовленные для изучения их под микроскопом.

2. Объекты исследования подразделяются на:

    живые (клетки в капле крови, клетки в культуре и другие);

    мертвые или фиксированные, которые могут быть взяты как от живого организма (биопсия), так и от трупов.

В любом случае после взятия кусочков они подвергаются действию фиксирующих растворов или замораживанию. И в научных, и в учебных целях используются фиксированные объекты. Приготовленные определенным способом препараты, используемые для изучения под микроскопом, называются гистологическими препаратами.

Гистологический препарат может быть в виде:

    тонкого окрашенного среза органа или ткани;

    мазка на стекле;

    отпечатка на стекле с разлома органа;

    тонкого пленочного препарата.

Гистологический препарат любой формы должен отвечать следующим требованиям:

    сохранять прижизненное состояние структур;

    быть достаточно тонким и прозрачным для изучения его под микроскопом в проходящем свете;

    быть контрастным, то есть изучаемые структуры должны под микроскопом четко определяться;

    препараты для световой микроскопии должны долго сохраняться и использоваться для повторного изучения.

Эти требования достигаются при приготовлении препарата.

3. Выделяют следующие этапы приготовления гистологического препарата

Взятие материала (кусочка ткани или органа) для приготовления препарата. При этом учитываются следующие моменты: забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти или забоя животного, а при возможности от живого объекта (биопсия), чтобы лучше сохранились структуры клетки, ткани или органа; забор кусочков должен производиться острым инструментом, чтобы не травмировать ткани; толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий раствор мог проникнуть в толщу кусочка; обязательно производится маркировка кусочка (указывается наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата забора и так далее).

Фиксация материала необходима для остановки обменных процессов и сохранения структур от распада. Фиксация достигается чаще всего погружением кусочка в фиксирующие жидкости, которые могут быть простыми спирты и формалин и сложными раствор Карнуа, фиксатор Цинкера и другие. Фиксатор вызывает денатурацию белка и тем самым приостанавливает обменные процессы и сохраняет структуры в их прижизненном состоянии. Фиксация может достигаться также замораживанием (охлаждением в струе СО2, жидким азотом и другие). Продолжительность фиксации подбирается опытным путем для каждой ткани или органа.

Заливка кусочков в уплотняющие среды (парафин, целлоидин, смолы) или замораживание для последующего изготовления тонких срезов.

Приготовление срезов на специальных приборах (микротоме или ультрамикротоме) с помощью специальных ножей. Срезы для световой микроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электронной микроскопии - монтируются на специальные сеточки.

Окраска срезов или их контрастирование (для электронной микроскопии). Перед окраской срезов удаляется уплотняющая среда (депарафинизация). Окраской достигается контрастность изучаемых структур. Красители подразделяются на основные, кислые и нейтральные. Наиболее широко используются основные красители (обычно гематоксилин) и кислые (эозин). Нередко используют сложные красители.

Просветление срезов (в ксилоле, толуоле), заключение в смолы (бальзам, полистерол), закрытие покровным стеклом.

После этих последовательно проведенных процедур препарат может изучаться под световым микроскопом.

Для целей электронной микроскопии в этапах приготовления препаратов имеются некоторые особенности, но общие принципы те же. Главное отличие заключается в том, что гистологический препарат для световой микроскопии может длительно храниться и многократно использоваться. Срезы для электронной микроскопии используются однократно. При этом вначале интересующие объекты препарата фотографируются, а изучение структур производится уже на электронограммах.

Из тканей жидкой консистенции (кровь, костный мозг и другие) изготавливаются препараты в виде мазка на предметном стекле, которые также фиксируются, окрашиваются, а затем изучаются.

Из ломких паренхиматозных органов (печень, почка и другие) изготавливаются препараты в виде отпечатка органа: после разлома или разрыва органа, к месту разлома органа прикладывается предметное стекло, на которое приклеиваются некоторые свободные клетки. Затем препарат фиксируется, окрашивается и изучается.

Наконец, из некоторых органов (брыжейка, мягкая мозговая оболочка) или из рыхлой волокнистой соединительной ткани изготавливаются пленочные препараты путем растягивания или раздавливания между двумя стеклами, также с последующей фиксацией, окраской и заливкой в смолы.

4. Основным методом исследования биологических объектов, используемым в гистологии является микроскопирование , т. е. изучение гистологических препаратов по микроскопом. Микроскопия может быть самостоятельным методом изучения, но в последнее время она обычно сочетается с другими методами (гистохимии, гисторадиографии и другие). Следует помнить, что для микроскопии используются разные конструкции микроскопов, позволяющие изучить разные параметры изучаемых объектов. Различают следующие виды микроскопии:

    световая микроскопия (разрешающая способность 0,2 мкм) наиболее распространенный вид микроскопии;

    ультрафиолетовая микроскопия (разрешающая способность 0,1 мкм);

    люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия для определения химических веществ в рассматриваемых структурах;

    фазово-контрастная микроскопия для изучения структур в неокрашенных гистологических препаратов;

    поляризационная микроскопия для изучения, главным образом, волокнистых структур;

    микроскопия в темном поле для изучения живых объектов;

    микроскопия в падающем свете для изучения толстых объектов;

    электронная микроскопия (разрешающая способность до 0,1-0,7 нм), две ее разновидности просвечивающая (трансмиссионная) электронная микроскопия и сканирующая или растровая микроскопии дает отображение поверхности ультраструктур.

Гистохимические и цитохимические методы позволяет определять состав химических веществ и даже их количество в изучаемых структурах. Метод основан на проведении химических реакций с используемым реактивом и химическими веществами, находящимися в субстрате, с образованием продукта реакции (контрастного или флюоресцентного), который затем определяется при световой или люминесцентной микроскопии.

Метод гистоавторадиографии позволяет выявить состав химических веществ в структурах и интенсивность обмена по включению радиоактивных изотопов в изучаемые структуры. Метод используется чаще всего в экспериментах на животных.

Метод дифференциального центрифугирования позволяет изучать отдельные органеллы или даже фрагменты, выделенные из клетки. Для этого кусочек исследуемого органа растирают, заливают физиологическим раствором, а затем разгоняют в центрифуге при различных оборотах (от 2-х до 150 тыс.) и получают интересующие фракции, которые затем изучают различными методами.

Метод интерферометрии позволяет определить сухую массу веществ в живых или фиксированных объектах.

Иммуноморфологические методы позволяет с помощью предварительно проведенных иммунных реакций, на основании взаимодействия антиген-антитело, определять субпопуляции лимфоцитов, определять степень чужеродности клеток, проводить гистологическое типирование тканей и органов (определять гистосовместимость) для трансплантации органов.

Метод культуры клеток (in vitro, in vivo) выращивание клеток в пробирке или в особых капсулах в организме и последующее изучение живых клеток под микроскопом.

Единицы измерения, используемые в гистологии

Для измерения структур в световой микроскопии используются в основном микрометры: 1 мкм составляет 0,001 мм; в электронной микроскопии используются нанометры: 1 нм составляет 0,001 мкм.

5. В истории развития гистологии условно выделяют три периода:

Домикроскопический период (с IV в. до н. э. по 1665 г.) связан с именами Аристотеля, Галена, Авиценны, Везалия, Фаллопия и характеризуется попытками выделения в организме животных и человека неоднородных тканей (твердых, мягких, жидких и так далее) и использованием методов анатомической препаровки.

Микроскопический период (с 1665 г. по 1950 г.). Начало периода связывают с именем английского физика Роберта Гука, который, во-первых, усовершенствовал микроскоп (полагают, что первые микроскопы были изобретены в самом начале XVII в.), во-вторых, использовал его для систематического исследования различных, в том числе биологических объектов и опубликовал результаты этих наблюдений в 1665 г. в книге "Микрография", в-третьих, впервые ввел термин "клетка" ("целлюля"). В дальнейшем осуществлялось непрерывное усовершенствование микроскопов и все более широкое использование их для изучения биологических тканей и органов.

Особое внимание уделялось изучению строения клетки. Ян Пуркинье описал наличие в животных клетках "протоплазмы" (цитоплазмы) и ядра, а несколько позже Р. Броун подтвердил наличие ядра и в большинстве животных клеток. Ботаник М. Шлейден заинтересовался происхождением клетокцитокенезисом. Результаты этих исследований позволили Т. Швану, на основании их сообщений, сформулировать клеточную теорию (1838-1839 гг.) в виде трех постулатов:

    все растительные и животные организмы состоят из клеток;

    все клетки развиваются по общему принципу из цитобластемы;

    каждая клетка обладает самостоятельной жизнедеятельностью, а жизнедеятельность организма является суммой деятельности клеток.

Однако вскоре Р. Вирхов (1858 г.) уточнил, что развитие клеток осуществляется путем деления исходной клетки (любая клетка из клетки). Разработанные Т. Шваном положения, клеточной теории актуальны до настоящего времени, хотя формулируется по-иному.

Современные положения клеточной теории:

    клетка является наименьшей единицей живого;

    клетки животных организмов сходны по своему строению;

    размножение клеток происходит путем деления исходной клетки;

    многоклеточные организмы представляют собой сложные ансамбли клеток и их производных, объединенные в системы тканей и органов, связанные между собой клеточными, гуморальными и нервными формами регуляции.

    Дальнейшее совершенствование микроскопов, особенно создание ахроматических объективов, позволило выявить в клетках более мелкие структуры:

    клеточный центр Гертвиг, 1875 г.;

    сетчатый аппарат или пластинчатый комплекс Гольджи, 1898 г.;

    митохондрии Бенда, 1898 г.

Современный этап развития гистологии начинается с 1950 г. с момента начала использования электронного микроскопа для изучения биологических объектов, хотя электронный микроскоп был изобретен раньше (Е. Руска, М. Кноль, 1931 г.). Однако для современного этапа развития гистологии характерно внедрение не только электронного микроскопа, но и других методов: цито- и гистохимии, гисторадиографии и других вышеперечисленных современных методов. При этом обычно используется комплекс разнообразных методик, позволяющий составить не только качественное представление об изучаемых структурах, но и получить точные количественные характеристики. Особенно широко в настоящее время используются различные морфометрические методики, в том числе автоматизированные системы обработки полученной информации с использованием компьютеров.

ЛЕКЦИЯ 2. Цитология. Цитоплазма

Гистология наука о микроскопическом и субмикроскопическом строении, развитии и жизнедеятельности тканей животных организмов.

Различают следующие иерархические уровни организации живой материи:

  • клеточный;
  • тканевой;
  • структурно-функциональные единицы органов;
  • органный уровень;
  • системный уровень;
  • организменный уровень

Объекты исследования гистологии

Объекты исследования подразделяются на:

  • живые (клетки в капле крови, клетки в культуре и другие);
  • мертвые или фиксированные, которые могут быть взяты как от живого организма (биопсия), так и от трупов.

Гистологический препарат

Гистологический препарат может быть в виде:

  • тонкого окрашенного среза органа или ткани;
  • мазка на стекле;
  • отпечатка на стекле с разлома органа;
  • тонкого пленочного препарата.

Гистологический препарат любой формы должен отвечать следующим требованиям:

  • сохранять прижизненное состояние структур;
  • быть достаточно тонким и прозрачным для изучения его под микроскопом в проходящем свете;
  • быть контрастным, то есть изучаемые структуры должны под микроскопом четко определяться;
  • препараты для световой микроскопии должны долго сохраняться и использоваться для повторного изучения.

Эти требования достигаются при приготовлении препарата.

Этапы приготовления гистологического препарата

Взятие материала (кусочка ткани или органа) для приготовления препарата.

Фиксация материала необходима для остановки обменных процессов и сохранения структур от распада.

Заливка кусочков в уплотняющие среды (парафин, целлоидин, смолы) или замораживание для последующего изготовления тонких срезов.

Приготовление срезов на специальных приборах (микротоме или ультрамикротоме) с помощью специальных ножей.

Окраска срезов или их контрастирование (для электронной микроскопии).

Просветление срезов (в ксилоле, толуоле), заключение в смолы (бальзам, полистерол), закрытие покровным стеклом.

Для целей электронной микроскопии в этапах приготовления препаратов имеются некоторые особенности, но общие принципы те же.

Из тканей жидкой консистенции (кровь, костный мозг и другие) изготавливаются препараты в виде мазка на предметном стекле, которые также фиксируются, окрашиваются, а затем изучаются.

Из ломких паренхиматозных органов (печень, почка и другие) изготавливаются препараты в виде отпечатка органа: после разлома или разрыва органа, к месту разлома органа прикладывается предметное стекло, на которое приклеиваются некоторые свободные клетки. Затем препарат фиксируется, окрашивается и изучается.

Наконец, из некоторых органов (брыжейка, мягкая мозговая оболочка) или из рыхлой волокнистой соединительной ткани изготавливаются пленочные препараты путем растягивания или раздавливания между двумя стеклами, также с последующей фиксацией, окраской и заливкой в смолы.

Методы исследования в гистологии

Основным методом исследования биологических объектов, используемым в гистологии является микроскопирование , т. е. изучение гистологических препаратов по микроскопом. Микроскопия может быть самостоятельным методом изучения, но в последнее время она обычно сочетается с другими методами (гистохимии, гисторадиографии и другие). Следует помнить, что для микроскопии используются разные конструкции микроскопов, позволяющие изучить разные параметры изучаемых объектов. Различают следующие виды микроскопии:

  • световая микроскопия (разрешающая способность 0,2 мкм) наиболее распространенный вид микроскопии;
  • ультрафиолетовая микроскопия (разрешающая способность 0,1 мкм);
  • люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия для определения химических веществ в рассматриваемых структурах;
  • фазово-контрастная микроскопия для изучения структур в неокрашенных гистологических препаратов;
  • поляризационная микроскопия для изучения, главным образом, волокнистых структур;
  • микроскопия в темном поле для изучения живых объектов;
  • микроскопия в падающем свете для изучения толстых объектов;
  • электронная микроскопия (разрешающая способность до 0,1-0,7 нм), две ее разновидности просвечивающая (трансмиссионная) электронная микроскопия и сканирующая или растровая микроскопии дает отображение поверхности ультраструктур.

Гистохимические и цитохимические методы позволяет определять состав химических веществ и даже их количество в изучаемых структурах. Метод основан на проведении химических реакций с используемым реактивом и химическими веществами, находящимися в субстрате, с образованием продукта реакции (контрастного или флюоресцентного), который затем определяется при световой или люминесцентной микроскопии.

Метод гистоавторадиографии позволяет выявить состав химических веществ в структурах и интенсивность обмена по включению радиоактивных изотопов в изучаемые структуры. Метод используется чаще всего в экспериментах на животных.

Метод дифференциального центрифугирования позволяет изучать отдельные органеллы или даже фрагменты, выделенные из клетки. Для этого кусочек исследуемого органа растирают, заливают физиологическим раствором, а затем разгоняют в центрифуге при различных оборотах (от 2-х до 150 тыс.) и получают интересующие фракции, которые затем изучают различными методами.

Метод интерферометрии позволяет определить сухую массу веществ в живых или фиксированных объектах.

Иммуноморфологические методы позволяет с помощью предварительно проведенных иммунных реакций, на основании взаимодействия антиген-антитело, определять субпопуляции лимфоцитов, определять степень чужеродности клеток, проводить гистологическое типирование тканей и органов (определять гистосовместимость) для трансплантации органов.

Метод культуры клеток (in vitro, in vivo) выращивание клеток в пробирке или в особых капсулах в организме и последующее изучение живых клеток под микроскопом.

Единицы измерения, используемые в гистологии

Для измерения структур в световой микроскопии используются в основном микрометры: 1 мкм составляет 0,001 мм; в электронной микроскопии используются нанометры: 1 нм составляет 0,001 мкм.

Исторические этапы развития гистологии

В истории развития гистологии условно выделяют три периода:

Домикроскопический период (с IV в. до н. э. по 1665 г.) связан с именами Аристотеля, Галена, Авиценны, Везалия, Фаллопия и характеризуется попытками выделения в организме животных и человека неоднородных тканей (твердых, мягких, жидких и так далее) и использованием методов анатомической препаровки.

Микроскопический период (с 1665 г. по 1950 г.). Начало периода связывают с именем английского физика Роберта Гука, который, во-первых, усовершенствовал микроскоп (полагают, что первые микроскопы были изобретены в самом начале XVII в.), во-вторых, использовал его для систематического исследования различных, в том числе биологических объектов и опубликовал результаты этих наблюдений в 1665 г. в книге «Микрография», в-третьих, впервые ввел термин «клетка» («целлюля»). В дальнейшем осуществлялось непрерывное усовершенствование микроскопов и все более широкое использование их для изучения биологических тканей и органов.

Особое внимание уделялось изучению строения клетки. Ян Пуркинье описал наличие в животных клетках «протоплазмы» (цитоплазмы) и ядра, а несколько позже Р. Броун подтвердил наличие ядра и в большинстве животных клеток. Ботаник М. Шлейден заинтересовался происхождением клетокцитокенезисом. Результаты этих исследований позволили Т. Швану, на основании их сообщений, сформулировать клеточную теорию (1838-1839 гг.) в виде трех постулатов:

  • все растительные и животные организмы состоят из клеток;
  • все клетки развиваются по общему принципу из цитобластемы;
  • каждая клетка обладает самостоятельной жизнедеятельностью, а жизнедеятельность организма является суммой деятельности клеток.

Однако вскоре Р. Вирхов (1858 г.) уточнил, что развитие клеток осуществляется путем деления исходной клетки (любая клетка из клетки). Разработанные Т. Шваном положения, клеточной теории актуальны до настоящего времени, хотя формулируется по-иному.

Современные положения клеточной теории:

  • клетка является наименьшей единицей живого;
  • клетки животных организмов сходны по своему строению;
  • размножение клеток происходит путем деления исходной клетки;
  • многоклеточные организмы представляют собой сложные ансамбли клеток и их производных, объединенные в системы тканей и органов, связанные между собой клеточными, гуморальными и нервными формами регуляции.
  • Дальнейшее совершенствование микроскопов, особенно создание ахроматических объективов, позволило выявить в клетках более мелкие структуры:
  • клеточный центр Гертвиг, 1875 г.;
  • сетчатый аппарат или пластинчатый комплекс Гольджи, 1898 г.;
  • митохондрии Бенда, 1898 г.

Современный этап развития гистологии

начинается с 1950 г. с момента начала использования электронного микроскопа для изучения биологических объектов, хотя электронный микроскоп был изобретен раньше (Е. Руска, М. Кноль, 1931 г.). Однако для современного этапа развития гистологии характерно внедрение не только электронного микроскопа, но и других методов: цито- и гистохимии, гисторадиографии и других вышеперечисленных современных методов. При этом обычно используется комплекс разнообразных методик, позволяющий составить не только качественное представление об изучаемых структурах, но и получить точные количественные характеристики. Особенно широко в настоящее время используются различные морфометрические методики, в том числе автоматизированные системы обработки полученной информации с использованием компьютеров.